甘蓝（Brassica oleracea L.）是十字花科芸薹属一年生或两年生植物。甘蓝营养性丰富,适应性与抗逆性较强,是世界许多国家广泛种植的重要蔬菜作物之一。甘蓝作物育种依赖杂种优势的利用,其大多数具有自交不亲和的特点,其自交系的选育需要人工授粉进行7-8代的自交或回交,这是一项费时而繁琐的工作。单倍体因其只含有单一亲本染色体组,可以通过秋水仙素加倍处理获得纯合一致的双单倍体（DH）,极大地缩短了育种年限,节约了劳动力成本。着丝粒特异组蛋白CenH3（人类中称为CENP-A）存在于真核生物的功能着丝粒中,对着丝粒在染色体上的定位起重要作用。Ravi和Chan发现,将拟南芥CenH3蛋白进行改造,即通过在其保守折叠域N端tail替换H3蛋白为H3.3蛋白,再添加绿色荧光蛋白标记GFP后获得tailswap-GFP,该CenH3变异体可以互补cenh3/cenh3突变体致死表型,互补后的植株作为母本与野生型父本杂交时可以诱导25%-45%的单倍体产生。此外,Sundaram Kuppu等人对由EMS诱变产生的多种突变体进行TILLING鉴定筛选,发现CenH3单个氨基酸的变化如第83位氨基酸由甘氨酸变为谷氨酸（G83E）、第155位由丙氨酸突变为苏氨酸（A155T）时也可以诱导单倍体的产生。在CENH3保守折叠域αN helix处2个氨基酸(G86T87)及11个氨基酸(G86TVALREIRHF96)的缺失同样具有单倍体诱导的功能。参照CenH3氨基酸突变体在拟南芥上诱导单倍体的成功应用结果,本研究构建了甘蓝CenH3氨基酸突变GA（G86E+A158T双突变）、RA（R127C+A158T双突变）、2a（αN helix缺失2个氨基酸）、11a（αN helix缺失11个氨基酸）、CENm（G86E）、tailswap-GFP等6个表达载体,各变异体表达框分别连锁一个用于阳性愈伤筛选及苗期鉴定的花青素合成相关基因MYB;种子阶段区分单倍体及非单倍体后代的种子特异表达基因m Cherry。利用农杆菌介导的遗传转化法成功将其转入甘蓝TO1000,主要结果如下:1.CenH3氨基酸变异体转基因植株的获得与表型鉴定。不同CenH3变异体基因甘蓝转化难度不同,经除草剂筛选,11a、2a、tailswap-GFP、CENm、GA变异体基因获得紫色愈伤组织,其中tailswap-GFP变异体获得生根植株18株;11a变异体获得生根植株11株;GA变异体获得生根植株2株。而RA变异体基因在转化过程中未发现有紫色愈伤组织出现。在各CenH3变异体基因转化过程中,频繁发生愈伤组织的自发死亡;根系发育缓慢甚至难以生根;同一色素积累植株顶端叶片紫色逐渐褪去甚至自然枯萎死亡;获得的转基因植株在炼苗时极易失水而死亡,水培及移栽至土壤均不能存活。以同样积累花青素的甘蓝转基因对照植株对比,发现转基因植株与对照之间气孔形态并无较大差异。Tailswap-GFP变异体植株的根系及叶片中能检测到不规则的GFP蛋白细胞核定位信号。2.色素合成相关基因MYB及外源、内源CenH3基因的表达分析。对tailswap-GFP变异体转基因植株红色叶片和绿色叶片组织的MYB基因表达检测显示MYB在红色叶片中的表达量显著高于绿色叶片中的表达水平。与野生型对比,11a及tailswap-GFP变异体基因在红色叶片组织和绿色叶片组织中的表达水平极低,但内源CenH3基因在红色和绿色叶片组织中的表达水平在两个变异体转基因植株中均显著上调表达。这结果与玉米Zm CENH3导入小麦后表达水平极低,但诱导了小麦内源CENH3的上调表达结果类似。且在玉米中发现内源CENH3的过表达会导致致死现象,也与本实验中发现的甘蓝愈伤组织以及转基因植株频繁衰老死亡现象一致。3.DNA损伤响应修复与叶片衰老相关基因的表达分析。对11a及tailswap-GFP变异体转基因植株红色和绿色叶片中相关基因的表达分析结果显示,相较于野生型对照,除NBS1以外,DNA损伤响应基因ATM、ATR、SOG1、WEE1及修复相关基因Ku70、Ku80、LIG4、RAD51均不同程度上调了表达,表明在转基因植株中确实发生了DNA损伤及修复过程。而在11a、tailswap-GFP转基因植株中转录因子WRKY53与ORE1;叶绿素降解PAO途径相关基因NYC1、SGR1、PPH、PAO;以及其他衰老相关相关基因NAP、SAG12、SAG13、SAG113也在不同程度上参与了叶片的衰老过程,这个结果与我们观察到的叶片衰老死亡现象相符合。因此,我们推测,各CenH3变异体在甘蓝植株中表达后,引起内源CenH3基因的上调表达,使细胞有丝分裂受到影响,细胞出现DNA损伤造成细胞周期停滞,损伤修复无法及时完成而导致细胞逐渐凋亡,引起植株早衰死亡。