弓形虫病是由弓形虫引起的一种世界范围流行的人兽共患寄生虫病,几乎能感染所有温血动物及部分冷血动物,宿主范围广泛。该病一方面会引起妊娠阶段孕妇流产,胎儿畸形、先天性缺陷或死胎,造成严重后果;另一方面还会导致艾滋病患者、癌症患者等免疫力低下人群出现心肌炎、肺炎或致死性脑炎等。人主要通过摄入含有弓形虫包囊的未煮熟的动物肉类及被弓形虫卵囊污染的水果、蔬菜、饮用水而感染弓形虫。因此,对动物弓形虫感染的监控与预防可有效控制弓形虫的传播流行。犬在弓形虫的生活史中扮演着重要角色,首先,犬可通过接触猫粪便而将弓形虫卵囊携带至人类生活区;其次,如果人类食入含有包囊的犬肉则会有感染弓形虫的可能。目前,弓形虫病临床血清学诊断方法主要有改良凝集试验(MAT)、间接血凝试验(IHA)、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等,这些方法具有较好的敏感性和特异性,但是需要在实验室条件下完成,且需要有经验的实验技术人员及相关的实验仪器、器材,实验要求高,不适合野外环境下检测。而免疫胶体金法作为新兴的快速检测方法完全有潜力承担并完成快速、简便的弓形虫病诊断任务。研究目的:原核致密颗粒蛋白GRA1、GRA7重组蛋白,建立间接ELISA方法检测犬弓形虫抗体,并与虫体裂解蛋白TLA比较评价,选出较优蛋白。利用该蛋白制备兔抗多克隆抗体,进而建立免疫胶体金快速检测方法,检测犬弓形虫抗体,为弓形虫病快速诊断提供方法。研究内容:1原核表达弓形虫重组蛋白GRA1、GRA7,建立犬弓形虫抗体间接ELISA方法,选出较优重组蛋白抗原,用于进一步研究;2用选出的重组蛋白制备抗体、纯化浓缩验证多抗反应性;3制备犬弓形虫抗体金标试纸条,并进行评价。研究方法:1弓形虫致密颗粒蛋白GRA1、GRA7的表达与纯化将实验室保种的含有重组质粒p ET28-GRA1的大肠杆菌DE3菌株及含有重组质粒p ET28-GRA7的大肠杆菌DE3摇床培养扩增,收取菌体,用不可溶蛋白提取液裂解提取目的蛋白。将提取蛋白跑SDS-PAGE后验证蛋白大小,并将目的蛋白做Western Blot验证反应性后,透析、浓缩目的蛋白,稀释至1mg/m L,-20℃保存。2弓形虫虫体裂解抗原TLA制备将液氮保存虫体复苏接种Vero细胞后,收集弓形虫速殖子,-80℃与室温反复冻融3次后,超声破碎,吸取上清稀释至1mg/m L,-20℃保存。3犬弓形虫抗体间接ELISA方法的建立及评价分别将GRA1、GRA7、TLA蛋白按照5μg/m L,5μg/m L,10μg/m L包被酶标板,包被过夜并用脱脂奶粉封闭1h,加入待检犬血清孵育1h,HRP标记羊抗犬二抗孵育1h,加入底物显色20min,用2M硫酸终止反应后酶标仪450nm测定OD值。将ELISA检测结果与金标准方法MAT、IFA共同检测结果比较,SAS统计分析,验证建立方法可行性。并用受试工作者曲线ROC分析ELISA检测结果,评价方法稳定性及统计分析敏感性、特异性。选出较优蛋白用于制备金标试纸条。4多克隆抗体制备将0.5m L的2mg/m L目的蛋白与等体积褔氏完全佐剂混合成油包水状态免疫兔,之后分别在一免后的2周、4周、6周将蛋白与褔氏不完全佐剂混合进行2免、3免、4免,免疫剂量减半。4免后7d时,采取少量血验证血清滴度及反应性。验证后大量采血分离血清。用蛋白柱A纯化Ig G抗体,透析浓缩后稀释至1mg/m L,-20℃保存。5免疫胶体金快速检测方法建立及评价通过柠檬酸三钠还原法制备胶体金,优化最佳蛋白包被量及p H值,将GRA7蛋白标记胶体金后铺金于金标垫上,将GRA7蛋白点在检测线上,控制线点兔抗GRA7多抗。将制备好的胶体金试纸条检测犬血清,检测结果与MAT、IFA确定结果比较、评价。研究结果:1成功建立了以GRA1、GRA7、TLA为抗原用以检测犬血清弓形虫特异性Ig G抗体的间接ELISA方法,蛋白包被浓度依次分别为5μg/m L、5μg/m L、10μg/m L,犬血清检测稀释浓度为1:50,抗哺乳动物Ig A/G酶标二抗稀释浓度为1:20000。将三种抗原建立的间接ELISA方法分别命名为GRA1-ELISA、GRA7-ELISA、TLA-ELISA,分别对259份犬血清检测,阳性率依次为16.2%,17.0%,16.2%。三种抗原建立的间接ELISA方法检测样品血清与IFA、MAT联合确定结果比较,阴阳性差异部分无显著性差异(p>0.05);阴阳性相同部分统计分析Kappa值依次为Kappa=0.7491,(95%CI:0.6390-0.8592);Kappa=0.8631,(95%CI:0.7803-0.9459);Kappa=0.8327,(95%,CI:0.7409-0.9245),由统计Kappa值显示GRA7-ELISA>TLA-ELISA>GRA1-ELISA,所以GRA7重组蛋白建立效果最好。ROC曲线分析显示,GRA1-ELISA、GRA7-ELISA、TLA-ELISA曲线下面积(AUC)依次为0.957(95%CI,0.919-0.995);0.973(95%CI,0.955-0.991);0.948(95%CI,0.911-0.986),由于GRA7-ELISA的AUC最接近于1,所以GRA7-ELISA表现出较好的稳定性。研究结果表明GRA7蛋白具有较好的抗原性,可用于进一步建立免疫胶体金快速检测试纸条的研究。2成功制备兔抗GRA7多抗,以GRA7为抗原ELISA检测滴度高于12800,以TLA为抗原ELISA检测滴度为3200。通过Western Blot验证制备纯化后的GRA7抗体,表明其与GRA7、TLA在目标蛋白大小处均有反应性。最终确定最佳蛋白包被p H值为8.0,最佳蛋白标记量为15.6μg/m L,金标抗原最佳铺金稀释度为1:10(50μL原液加450μL重悬液);T检测线GRA7蛋白划线浓度为0.5mg/m L,C检测线兔抗GRA7多抗划线浓度为0.5mg/m L;稳定性试验验证试纸条室温保存至少一个月有效,4℃保存至少半年有效。用GRA7为抗原的胶体金试纸条(GRA7-IC)对259份犬血清检测,样品阳性率为15.8%,低于GRA7-ELISA样品阳性率(17.0%)。GRA7-IC与IFA、MAT联合确定的阴阳性血清比较,阴阳性不同部分用Mc Nemar chi-square统计分析无显著性差异(p>0.05);结果相同部分比较显示Kappa=0.7889,(95%CI:0.6864-0.8914),说明两种方法具有较高一致性,结果一致正确率为94.2%。检测结果显示该法敏感性为79.5%,特异性为97.2%。研究结论:1.建立了重组抗原GRA1、GRA7及TLA的弓形虫抗体间接ELISA方法,重组GRA7-ELISA敏感性、特异性高于GRA1-及TLA-ELISA;2.成功制备兔抗GRA7抗体,ELISA及Western Blot验证该抗体与GRA7蛋白及虫体裂解蛋白TLA均有良好的反应性;3.制备了犬弓形虫抗体金标试纸条,敏感性为79.5%,特异性为97.2%,可作为犬弓形虫病快速诊断方法。