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目的:乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一种特异性感染人肝细胞的DNA病毒,基因组大小为3.2 kb,病毒通过逆转录方式进行复制。多胺是普遍存在于哺乳动物细胞中带正电荷的小分子,主要调节核酸结构,细胞增殖和信号传导等。最近研究发现多胺参与调控多种病毒的复制周期:包括病毒基因组复制,核酸结构包装和蛋白质合成。同时,鸟氨酸脱羧酶1(ornithinedecarboxylase,ODC1)是调控多胺代谢途径的关键限速酶,ODC1不可逆的抑制剂二氟甲基鸟氨酸(Difluoromethylornithine,DFMO)可以明显抑制巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)等DNA病毒和寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)、登革热病毒(Dengue virus,DENV)等RNA病毒的感染复制。但是尚不清楚多胺代谢是否调控乙肝病毒复制,以及DFMO是否能够作为抗乙肝病毒的新药。因此本文主要研究了多胺代谢与HBV复制的相关性:一方面探索了HBV感染调控多胺代谢关键酶ODC1和亚精胺合成酶(spermidine synthase,SRM)的表达,进一步通过基因功能实验鉴定了代谢基因ODC1和代谢产物多胺调控病毒复制的表型,明确了多胺代谢与HBV复制的相关性;另一方面初步发现DFMO通过作用病毒蛋白HBc的泛素化降解,降低HBc的表达水平和病毒颗粒的水平,从而限制病毒DNA复制。研究结果有助于阐明宿主多胺代谢调控HBV复制的分子机制,并把ODC1作为新的抗病毒靶点和DFMO作为新的抗乙肝新药奠定基础,实现“机制解析-抗病毒靶点确定-抗病毒药物评价”三个环节的统一。方法:第一部分:多胺代谢与HBV复制的相关性:(1)首先在HBV稳定复制细胞系Hep AD38以及Hep G2-NTCP的感染细胞中检测了HBV感染复制与多胺代谢相关基因表达的关系:通过real-time PCR和Western blot检测病毒复制对多胺代谢相关基因ODC1、SRM和精胺合成酶(spermine synthase,SMS)表达的影响,探索病毒复制与多胺代谢基因表达的相关性。(2)在Hep AD38细胞通过si RNA干扰内源性的ODC1和SRM,提取胞质中总RNA、总蛋白质以及病毒核心颗粒DNA等,通过ELISA、real-time PCR、Western blot和Capsids等实验技术来检测HBV复制参数的变化,探索多胺代谢关键酶调控病毒复制的表型。(3)探索ODC1不可逆的特异性抑制剂DFMO对HBV复制的抑制作用:通过MTS方法确定DFMO对Hep AD38或Hep G2.2.15细胞的毒性范围区间,进一步用DFMO直接处理Hep AD38和Hep G2.2.15细胞,通过ELISA、real-time PCR、Western blot和Capsids等实验技术方法来检测DFMO对HBV复制的抑制效应。(4)探索代谢产物多胺对病毒复制的调控作用:通过DFMO预处理细胞降低细胞内多胺含量,再加入外源性的多胺混合物,精胺或亚精胺,采用ELISA、real-time PCR、Western blot和Capsids等方法,检测代谢产物多胺对HBV复制的调控作用。第二部分:DFMO抑制HBV复制的分子机制:(1)探索多胺代谢产物调控HBc表达的效应:在Hep G2细胞中分别转染3x Flag-HBc、3x Flag-HBs和3x Flag-HBx的表达质粒,DFMO处理细胞后用real-time PCR和Western blot实验分别检测DFMO对这三种病毒蛋白m RNA和蛋白质水平的影响。通过si RNA干扰内源性的el F5A1和el F5A2,利用real-time PCR检测病毒核心颗粒DNA含量的变化,Western blot分析病毒蛋白质的变化,从基因转录,蛋白质翻译和蛋白稳定性三个环节探讨多胺调控HBc表达的环节。(2)探索DFMO调控HBc泛素化,抑制HBV复制的机制。用DFMO分别作用于Hep AD38细胞和Hep G2细胞后,再分别用CHX和MG132处理细胞,Western blot检测DFMO是否影响HBc蛋白质的稳定性和泛素化。结果:第一部分:多胺代谢与HBV复制的相关性:(1)在Hep AD38细胞系中,去除四环素培养启动HBV复制后,随着病毒复制的增强,多胺代谢基因ODC1、SRM表达显著增加。当病毒感染Hep G-NTCP细胞后,ODC1和SRM基因表达增加,提示多胺代谢相关限速酶与HBV复制具有一定的相关性。(2)Hep AD38细胞中干扰ODC1和SRM,HBV DNA复制水平分别下降40%和33%左右,蛋白质与病毒颗粒也有明显减少,但是上清中的HBs Ag并无明显变化,表明干扰ODC1和SRM的表达可以抑制HBV DNA的复制。(3)MTS结果表明:DFMO在较高浓度200μM下对Hep AD38细胞无毒性。通过ELISA和real-time RT-PCR实验发现DFMO不影响细胞上清中的HBs Ag的分泌和细胞内病毒3.5kb m RNA的水平。但是通过Southern blot、Western blot和Capsids检测发现HBV DNA水平,HBc蛋白水平以及病毒颗粒水平明显减少,说明DFMO可能通过降低HBc蛋白质水平来抑制HBV DNA的合成。(4)外源性的多胺混合物以及单一多胺(精胺或亚精胺)处理Hep AD38细胞后,采用real-time PCR、Western blot和Capsids检测外源多胺对HBV复制的影响,结果表明多胺能促进HBc蛋白的表达和病毒DNA的复制。第二部分:DFMO抑制HBV复制的分子机制:(1)在Hep G2细胞分别转染HBx、HBc、HBs的表达质粒,DFMO处理后,通过real-time RT-PCR和Western blot检测发现DFMO能明显降低HBc蛋白质水平,而对其他病毒蛋白HBx和HBs无作用,同时DFMO对HBc RNA水平无明显影响,提示DFMO抑制HBc主要发生在蛋白水平。进一步通过si RNA干扰el F5A1和el F5A2后,real-time PCR和Western blot检测发现HBV复制无明显变化,提示真核生物翻译因子el F5A不影响HBc蛋白质的翻译。(2)DFMO预处理的Hep G2和Hep AD38细胞中分别加入CHX和MG132,通过Western blot检测HBc蛋白水平,结果表明DFMO调控了HBc蛋白的稳定性和泛素化。结论:HBV感染复制调控多胺代谢关键酶ODC1的显著表达,ODC1和代谢产物多胺显著调控病毒HBc蛋白和病毒DNA的复制,表明多胺代谢与HBV复制存在一定的相关性;ODC1抑制剂DFMO能显著抑制HBc蛋白和病毒DNA的复制,具有一定的抗病毒效应,其作用机制是通过影响HBc蛋白质的泛素化来降低HBc蛋白质的稳定性,从而发挥其抗病毒作用。