布尔门是一种二进制的电路设计元件,能够接收一个或两个输入信号进行运算,结果输出一个二进制信号,常用于电气设计领域。布尔*盖茨也是已知的作为逻辑门。他们的名字命名的19世纪的数学家乔治*布尔,他曾在数代数系统的逻辑。Boolean门在生物学允许门的人口的细胞基于’和’,’或’和’不’逻辑的。这可能是有用的,为寻找细胞群体表达其抗原a和b中,但不是c.布尔的大门是有用的,当分类细胞染色的多荧光探测器。例如,如果你有一个复杂的分层的门方案,它可以是有用的,添加一个’不’门。这是为了确保你们的排序只有细胞,你的兴趣。你还可以添加布尔门到你的层次门当寻找稀有的分人口,沾满了多的染料。利用布尔门构建运算功能序列是一件不容易的事。目前,在微生物的布尔门能够实现基于DNA构建的简单运算或者构建生物传感器。而且,将布尔门最终用于体内研究是合成生物学目前研究热点之一。这个项目基于RNA干扰技术(RNA interference)在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae构建布尔门逻辑的检测系统,尤其是构建非门(NOT gates),当输入含0时,输出为1,反之亦然,0和1分别代表待测物浓度的高低(输入)以及荧光水平的高低(输出)。在最简单的情况下,布尔门使用两个输入信号来计算单个逻辑输出。更复杂的数字电路将N个输入转换为单个输出。在这两种情况下,输入-输出关系由真值表示,其中每个条目指定输入信号值和相应的二进制输出的N个组合的可能的2的功率之一。在生物学方面,数字电路的重要原因有几个。首先,逻辑门,例如由两个不同的激活剂对启动子的作用确定的逻辑门在自然系统中是丰富的。它们通常与前馈循环(FFL)图案相关联并提供更复杂的功能,例如符号敏感延迟和脉冲发生。与基本布尔门相互作用的几个FFL的更复杂的网络控制枯草芽孢杆菌以及秀丽隐杆线虫的神经元系统的孢子形成。因此,对逻辑门的可能实现的分析可以帮助我们进一步了解自然生物网络。在合成生物学方面,其次,构建生物传感器和分子计算机需要复杂的数字电路。生物传感器应对可能用真值表指定的明确的外部线索进行回应。可以感测到的输入越多,(数字)生物传感器能够区分类似的环境条件越好。这种生物传感器可以例如集成到用于生产生物燃料的生物反应器中。此外,它们可以在疾病治疗中发挥重要作用。例如,生物传感器被实现以模拟逻辑门来控制细胞侵袭肿瘤细胞响应肿瘤环境的信号。甚至更复杂的生物传感器可以作为分子计算机工作,根据感测到的物质进行诊断,并在必要时释放药物。本项目中的逻辑运算由RNAi技术来实现的.RNAi是首字母缩略词,指的是在RNA的接口。这是一种系统内发生的活细胞中发挥着至关重要的作用,控制活性的基因。它还有助于确定和影响如何,这些基因都在积极工作。核心的RNA口指的是两种不同类型的小类型的RNA分子。这些都是mi RNA或者也称为mirna的。其他组成部分是核酸或称为小干扰RNA。基本上,Rna的产品基因的,这些还可以结合其他的基因,如性。这实际上可能影响的活动的化合物是否增加或减少。一个最突出的角色的RNAi是用于防御的细胞尤其是在打击对某些寄生虫的基因。这些都是寄生虫的基因,它被称为座子和病毒。最重要的是,还必须在正确的方向发展的单元和一般的基因的表达。双链RNA能够激活特定的基因沉默通路,能够引起特定基因沉默。这种沉默通路在很多真核生物中都存在,但酿酒酵母中却没有。我们通过导入来自S.castellii and C.albicans中的Dicer和Argonaute蛋白基因,使酿酒酵母获得完整的RNAi通路。本项目中,我们主要测试了三个不同的si RNA产生途径的逻辑设计。在第一个设计中si RNA是由一个长的发夹结构;第二个设计中,我们利用一个双向启动子来启动si RNA的表达;第三个设计,我们利用两个不同的启动子来分别表达RNA分子和它的反向互补序列。这三个逻辑设计在酵母细胞中具体都以半乳糖的有无作为输入,培养液中含半乳糖,则输入为1,反之则为0,输出则为酵母细胞表达绿色荧光蛋白的量。si RNA前体由半乳糖操纵型启动子诱导,当培养液中存在半乳糖时,si RNA前体的表达会被激活,Dicer蛋白会与表达的si RNA前体交联,将其解螺旋为单链si RNA,si RNA进而与Argonaute蛋白相结合,使得si RNA能够识别以及与绿色荧光蛋白的m RNA结合,从而降低绿色荧光蛋白的表达。该回路设计最终实现的结果是,当酵母培养液中含有半乳糖时,即输入为1,则酵母不表达绿色荧光,输出为0,反之,则表达大量荧光蛋白,即输出为1。我们利用双向启动子以及同义-反义结构成功构建了工作情况良好的非门酵母菌,但没能完成发夹结构检测模型的构建。根据Drinnenberg和共同作者,这是由于事实上反义的启动,可能在近的轨迹那里的质粒是综合的、导致转录核酸前体的葡萄糖含媒体。作为第一个测试这个假设我们放的录单元包含hairpin到一丝质粒。然后,我们改变了新的矢量转酵母。原则上,丝质粒不应包含任何反义酵母菌剂。然而,最终的结果并没有改变。然后,我们要求金唯智公司合成一个新的质粒的发夹在哪里序之后是两个终端:一个在感觉方向的(通常的),和一个在反义的方向。后者应防止RNA聚合酶二抄录的核酸前体结合后一种促进在反DNA链。再次,合成DNA序列中含有一个长长的发夹原来是困难的,甚至一个公司并且我们并没有接受这种质粒。为了证实si RNA可以沉默S.castellii中的一个基因,并创造出用于监测发芽酵母RNAi的工具,Drinnenberg和共同作者产生了两个设计用于沉默绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的构建体(强和弱)。两个沉默构建体都在诱导型启动子的控制之下,并且各自整合到表达GFP的野生型,Dago1和Ddcr1菌株的染色体中。两个构建体和两个诱导条件产生GFP si RNAs的梯度。在含有AGO1(Argonaute)和DCR1(Dicer)的细胞中,通过荧光激活细胞分选(FACS)测量的GFP沉默的量对应于具有最高水平的si RNA产生抑制的GFP si RNA的水平荧光到背景自发荧光。如预期的那样,沉默取决于DCR1用于si RNA生产,AGO1用于si RNA功能。这些结果证实si RNA可以使基因沉默起作用,并且证明靶向的转录物可以源自与产生si RNAs不同的基因座。通过仅使用Ago1和Dcr1在酿酒酵母中重建RNAi的能力提高了S.castellii RNAi途径仅需要这两种蛋白质的可能性。这种简单性将使得出芽的酵母RNAi与所有已知的RNAi途径不同,所述RNAi途径使用参与例如沉淀复合物的Argonaute加载或成熟的其它蛋白质。将存在于Dcr1同二聚体中的四个ds RBD可能解释不存在单独的负载因子。或者,Ago1,Dcr1和发夹前体的过表达可能足以在酿酒酵母中产生RNAi,但是当在S.castellii中的生理水平表达时,它们可能需要额外的因子用于有效的沉默。另一种可能性是重构途径使用自酿酒酵母近来丢失RNAi后已被维持的成分。在今后的研究中,我们计划通过降低绿色荧光蛋白的表达水平来提高非门构建的功能,以及尝试多种分子诱导RNAi表达,实现相对复杂的布尔门的功能。