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研究背景和目的原发性肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是世界上发病率居第5位的癌症,也是排名第3的肿瘤死亡原因。HCC的发病率具有明显的性别差异性,在男性中发病率约为女性的2-4倍。肝炎病毒仍然是HCC的主要风险因素,但在发达国家,非酒精性脂肪肝和糖尿病是两个重要的风险因素。糖尿病（DM）是HCC的一项独立风险因素。此外,不少证据也显示DM还可以显著提高HCC特异性死亡率,增加总死亡率,降低无复发生存期,提示DM对HCC预后也有不良影响。因此,DM是影响HCC发生发展及预后的一个重要因素。然而糖尿病与HCC之间关联的分子机制仍未明确。炎症、脂类代谢、糖代谢和能量代谢异常、胰岛素抵抗、大量的胰岛素产生可能是糖尿病与肝癌发生过程中的一个重要因素。HCC的形成是一个复杂的多步骤过程,需要积累多条通路的异常变化。目前发现的主要基因突变包括TP53,βcatenin、AXIN1。染色体扩增主要发生在1q、6p、8q、17q、20q,染色体缺失主要发生在 4q、8p、llq、13q、16q 和 17p。HCC中的表观遗传学改变尚无明确机制,但是有研究显示HCC中出现RASSF1、SOCS1、E-caderin等肿瘤抑制基因的失活和MYC等原癌基因的激活。miRNA也能调节HCC发生发展中关键的原癌基因表达。上述变化导致涉及细胞生存和增殖的信号通路如EGFR、RAS、mTOR、HGF、c-MET、Wnt等发生激活改变。NCOA5（也称CIA）是一种不依赖于AF2的共刺激因子,同时具有一段共刺激和共抑制域,可以调节ERα的转录。一项基因分析发现,NCOA5是2型糖尿病（T2D）的倾向性基因,位于T2D高度相关的染色体20q12-13.1区域。HuaXiao教授前期实验中发现NCOA5单倍体不足的雄性小鼠容易发生HCC,在发生肿瘤前小鼠表现出L-6表达升高、早期糖耐量受损、进展性脂肪性肝炎和肝脏增生异常。因此我们采用了定量PCR方法在人的HCC肿瘤组织和癌旁组织中进行了NCOA5 mRNA表达水平检测,并分析了 NCOA5在肝癌中与各临床病理参数之间的关系;在对患者NCOA5进行测序分析时发现了一种新的NCOA5剪接体,命名为sNCOA5,随后继续检测了前述标本中sNCOA5的表达及其与临床病理参数直接的关联。在前期实验中建立的NCOA5单倍体敲除模型由于不能产生纯合体敲除小鼠,并且雄性小鼠具有生育能力缺陷,为了进一步研究NCOA5在细胞分子水平的生理病理机制,我们设计构建了条件性敲除NCOA5的质粒,并通过电转染、显微注射方法获得了嵌合体小鼠,为未来更深入的了解NCOA5在不同时期不同部位的作用机理奠定基础。此外我们在欧美HCC人群发现一个NCOA5位点的单核苷酸改变,命名为NCOA5T445A,构建了诱导表达NCOA5的tet on系统质粒和病毒,筛选出能够在多西环素刺激下过表达NCOA5的肝癌细胞株,并进行了初步的生物学行为分析,为研究NCOA5T445A对人HCC发生发展的影响提供线索。方法1.定量PCR技术分析NCOA5 mRNA、sNCOA5在人原发性肝细胞癌肿瘤组织和癌旁组织的表达应用荧光定量PCR技术分析了 30对原发性肝癌肿瘤组织和癌旁组织及3例非原发性肝癌肝脏组织的NCOA5mRNA表达水平,并对组织进行NCOA5测序,发现sNCOA5后分析了上述患者肿瘤和癌旁组织中sNCOA5 mRNA表达水平,并收集了患者的年龄、性别、病理分级、肿瘤大小、静脉癌栓,肝炎病毒状态及定量,AFP,CHILD评分,糖尿病史等临床病历特征进行分析。2.设计构建NCOA5条件性敲除质粒及小鼠采用在线数据库和软件设计NCOA5条件性敲除质粒,通过PCR、酶切、电泳、产物回收、连接等分子生物学方法构建了含有上下游同源重组臂、两个FRT包含的neo片段和两个loxP位点包含的NCOA5外显子3的plox Frt Ncoa5,线性化的质粒电转染胚胎干细胞后通过新霉素筛选扩增得到含有上述片段的阳性重组细胞,并显微注射入囊胚,以获得嵌合体小鼠。3.NCOA5T445A对肝癌细胞生物学特性的影响自行设计构建PREV-TRE-NCOA5、PREV-TRE-NCOA5T445质粒,通过转染Phoenix细胞包装逆转录病毒。以PREV tet on逆转录病毒感染PLC/PRF/5细胞和Hep3B细胞并进行G418筛选构建了能够受四环素或多西环素调控的相应细胞株,并用PREV-TRE-luc瞬时转染细胞后以双荧光素酶检测系统检测了细胞株受多西环素调控的程度。并以 PREV-TRE-CON、PREV-TRE-NCOA5 和 PREV-TRE-NCOA5T445A相应逆转录病毒感染HepG2 tet on细胞和PLC/PRF/5 tet on细胞,通过潮霉素筛选获得能够受四环素或多西环素调控NCOA5或NCOA5T445A表达的稳定细胞株。利用MTT法检测NCOA5或NCOA5T445A过表达对肝癌细胞体外增殖的影响:流式细胞术和Westernblot分析NCOA5或NCOA5T445A过表达对肝癌细胞周期的影响。4.统计分析应用SPSS13.0软件进行统计学处理,每对肝癌组织和相应癌旁组织野生型NCOA5 mRNA和sNCOA5 mRNA表达以独立t检验比较,NCOA5和sNCOA5表达与临床病理特征的比较中,与年龄、性别、门静脉癌栓、肿瘤大小、病理分级、HBsAg的关联以独立样本t检验进行分析,与HBV定量、AFP、ALB、ALI、AST、DBIL、TBIL、IBIL、PTINR 关联以 spearman 法进行相关分析。Western blot实验、MTT实验中数据以析因分析进行比较。细胞周期数据应用ONE WAY ANOVA进行比较,组间的多重比较应用方差齐的LSD法。P<0.05为有统计学意义。结果1、定量PCR技术分析NCOA5 mRNA、sNCOA5在人原发性肝细胞癌肿瘤组织和癌旁组织的表达在30例HCC患者中,约40%在肝癌组织中野生型NCOA5 mRNA表达比相应的癌旁组织显著降低（P<0.05）。相比于3例对照组正常肝脏组织,在30例HCC患者中,63%癌旁组织的野生型NCOA5 mRNA表达显著下降（P<0.05）,并下降超过对照组正常肝脏组织表达的50%。对9对国内HCC患者肝脏肿瘤和癌旁组织标本的NCOA5 cDNA测序发现了 NCOA5的一种缺乏转录激活端的选择性剪接体sNCOA5。sNCOA5由406个氨基酸组成,外显子7尾部获得23个来自内含子7的氨基酸,从而获得延伸并且导致框移突变而且引起终止子提前出现,蛋白质翻译提前终止。30例HCC患者中,约43%在肝癌组织sNCOA5 mRNA表达比相应的癌旁组织显著升高（P<0.05）。Western Blot在4例肝癌组织中有2例升高。29例HCC患者的临床特征与野生型NCOA5 mRNA和sNCOA5 mRNA表达水平进行相关分析发现,患者的野生型NCOA5或sNCOA5表达水平与年龄、肿瘤大小、病理分级、门静脉癌栓状态、AFP、ALB、ALT、AST、DBIL、TBIL、IBIL、PT-INR、HBVAg.HBVAb 无显著关联（P>0.05）,sNCOA5 与 HBV 病毒定量呈现正相关（spearman系数为0.592,P=0.043）。2、构建plox Frt Ncoa5和条件性敲除小鼠从SVJ129小鼠cDNA文库中利用PCR钓取5’端同源重组臂约2.0Kb,3’端同源重组臂约3.55Kb,及目的片段外显子3及邻近内含子片段（Exon3）,长约1.25Kb。构建了质粒PCR2.1 up,PCR2.1 down,PCR2.1 Ex3,PBS E3,PCR Cla-E3-loxp,ploxP E3,ploxP ED,ploxP FRT-NEO ED 和 plox Frt Ncoa5。电转染 ES细胞后通过PCR筛选出阳性重组克隆,扩增显微注射到C57/BL6小鼠后获得31个嵌合体小鼠。3、NCOA5T445A对肝癌细胞生物学特性的影响构建了 PREV-TRE-CON、PREV-TRE-NCOA5、PREV-TRE-NCOA5T445A 的逆转录病毒载体和能够受多西环素调控的Hep3B和PLC/PRF 5肝癌细胞。包装逆转录病毒后感染建立 HepG2 tet on NCOA5/NCOA5T445A 和 PLC/PRF 5 tet on NCOA5/NCOA5T445A 细胞。Western blot 检测提示 HepG2 tet on(和 PLC/PRF/5 tet on NCOA5/NCOA5T445A细胞受多西环素调控能够大量过表达NCOA5和NCOA5T445A。MTT法观察NCOA5和NCOA5T445A基因诱导过表达前后体外细胞的生长情况发现,HepG2组细胞在诱导前后增殖速度均有显著差异（F=2.956,P=0.049;F=67.662,P<0.001）,PLC/PRF5组细胞在诱导前后增殖速度也均有显著差异（F=10.794,P<0.001;F=81.829,P<0.001）。利用流式细胞术检测 HepG2 组细胞的细胞周期的变化,结果显示NCOA5/NCOA5T445A基因少量过表达能够引起Hep2G2细胞株细胞周期中G2M期的比例明显增加,差异具有统计学意义（F=522.991,P<0.001）。受到诱导产生大量NCOA5或NCOA5T445A表达时,三种细胞也有类似的周期变化（F=87.773,P<0.001）。Western blot结果提示CyclinB1在NCOA5和NCOA5T445A组中表达较对照组降低,NCOA5组中较NCOA5T445A组降低。综合结果表明NCOA5和NCOA5T445A过表达后,肿瘤细胞体外生长被显著抑制（P<0.001）,NCOA5T445A的肿瘤抑制功能较野生型NCOA5 减弱（P<0.001）。结论1.NCOA5在原发性肝癌组织中表达降低,表明NCOA5在人原发性肝癌中可能重要的抑癌基因;2.sNCOA5在原发性肝癌组织中表达升高,可能是NCOA5部分失活表现,并与HBV定量相关,可能作为临床肝癌监测和检测的重要肿瘤标志物;3.构建了 NCOA5条件性敲除质粒及嵌合体小鼠,可能为研究NCOA5的特异性表达及作用提供实验模型。4.NCOA5基因是原发性肝癌的发生发展的重要抑制基因,能够通过阻滞细胞在G2M期抑制细胞增殖。NCOA5T445A单个氨基酸的改变能够削弱这一作用。本研究的创新之处1.发现NCOA5表达降低、sNCOA5表达升高与肝癌的发生发展相关,为开展肝癌个体化治疗奠定了理论基础;2.建立了可用于NCOA5条件性敲除的嵌合体小鼠,为建立部位、时间特异性敲除NCOA5或者纯合性敲除NCOA5的小鼠提供基础。3.发现NCOA5 一个新的单氨基酸改变,这个改变与HCC有关,并且能够减弱NCOA5野生型的抑癌作用。利用逆转录病毒载体建立了两株能够过表达NCOA5和NCOA5T445基因的肝癌细胞株,为研究NCOA5和NCOA5T445A的功能提供了有价值的研究工具;