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研究目的:在优化人精浆miRNAs提纯方法的基础上,研究不同类型男性不育症患者精浆miR-106b的表达变化,探索miR-106b作为诊断男性不育分子靶标的可能性;并且以不同发育时期的小鼠睾丸,小鼠精原细胞(GC-1)和精母细胞(GC-2)细胞系为材料,研究miR-106b对生精细胞功能的影响及其分子机制。研究方法:1.优化及验证人精浆miRNAs提纯方法:收集国家卫生计生委科研所生殖健康服务中心就诊者精液样本。根据不同RNA提取方法分为4组:Trizol LS组、蛋白酶 K+Trizol LS 组、miRNeasy Micro kit 组及 Trizol LS+miRNeasy Micro kit联合使用组(改良组)。比较4组提纯精浆RNA的OD260/280,使用Agilent2100生物分析仪检测改良法提纯精浆miRNA的纯度和质量,比较4组Real-time PCR检测精浆miR-106b和miR-9表达丰度的溶解曲线。2.miR-106b在男性不育症患者精浆中的表达变化:收集国家卫生计生委科研所生殖健康服务中心的正常精浆样本(精液常规检查参数正常且一年内配偶怀孕并正常分娩)15例,非梗阻性无精子症精浆样本(临床确诊)30例,弱精子症精浆样本(临床确诊)10例。Real-time PCR检测正常组(n=5)、非梗阻性无精子症组(n=10)miR-106b的表达量,结果显示有显著差异,进一步扩大样本量,正常组(n=10)、非梗阻性无精子症组(n=20)并添加弱精子症组(n=10)检测miR-106b的表达量。3.mmiR-106b对生精细胞功能的影响及其分子机制:(1)Real-time PCR检测miR-106b在不同发育时期(7d,14d,21d,35d,64d)小鼠睾丸组织中表达水平。(2)慢病毒包装miR-106bmimics(模拟物),miR-106b inhibitor(抑制物),miR-106b mimics control(模拟物对照)和miR-106binhibitorcontrol(抑制物对照),感染GC-1、GC-2,通过共聚焦显微镜和Real-time PCR检测及鉴定稳定感染的细胞株。MTS法检测感染慢病毒后GC-1、GC-2的增殖情况,流式细胞术检测miR-106b对GC-1、GC-2凋亡及细胞周期的影响。(3)通过生物信息学分析软件预测miR-106b可能的靶基因,筛选与生精细胞增殖凋亡相关的基因,Real-time PCR检测其在上述慢病毒感染的各细胞株中的表达变化,比较其与miR-106b的表达趋势,初步判断其为miR-106b靶基因的可能性。研究结果:1.(1)改良组提纯的精浆RNA OD 260/280为(1.90±0.03)显著高于其它三组(p<0.05)。(2)改良组提纯的miRNA通过Agilent 2100生物分析系统检测,色谱图位置特异性明显,峰值清晰,质量合格,能满足后续实验的要求。(3)Real-time PCR检测miR-106b显示,以前三组为模板的溶解峰不单一,非特异性扩增明显,改良组的溶解曲线标准,峰型窄而尖。Real-time PCR检测miR-9显示,前两组方法峰型不单一,具有非特异性扩增,第三组虽具有单一峰型,但上升曲线相较于改良组,不够平滑。2.小样本Real-time PCR检测miR-106b在精液参数正常精浆样本和非梗阻性无精子症患者精浆中的表达丰度,结果显示miR-106b在非梗阻性无精子症患者精浆样本中表达量显著低于正常对照(P<0.01),扩大样本量检测精液参数正常精浆样本(n=10)、非梗阻性无精子症精浆样本(n=20)和弱精子症精浆样本(n=10)中miR-106b的表达丰度,结果显示miR-106b在非梗阻性无精子症组及弱精子症组的表达量均显著低于正常对照组(P<0.01),在弱精子症样本中的表达量显著高于非梗阻性无精子症(P<0.05)。3.(1)Real-time PCR检测miR-106b在不同发育时期小鼠睾丸组织中表达情况,发现第7天时miR-106b的表达量最高,从7～35天,miR-106b的表达量随着小鼠睾丸的发育呈逐渐降低的趋势(P<0.01),35天与64天相比,小鼠睾丸组织中miR-106b的表达量无显著变化。(2)慢病毒感染GC-1、GC-2后,共聚焦显微镜下观察到绿色荧光亮度很强,感染率高达85%。Real-time PCR检测结果显示慢病毒感染后GC-1、GC-2中miR-106b mimics组与miR-106b mimics control 组相比,表达量显著升高(P<0.01),miR-106b inhibitor 组与 miR-106b inhibitor control 组相比,表达量显著降低(P<0.01)。(3)在GC-1、GC-2中,miR-106b mimic组与其对照组相比细胞增殖能力有所增强,差异具有统计学意义(P<0.05),而miR-106b inhibitor组的趋势正好和miR-106b mimics组相反,抑制miR-106b表达后,GC-1、GC-2的细胞增殖能力均有所减弱(P<0.05),差异具有统计学意义。说明miR-106b具有促进生精细胞增殖的作用。(4)流式细胞术检测结果显示:在GC-1、GC-2中,miR-106bmimics组与其对照组相比,细胞凋亡率显著降低,miR-106b inhibitor与其对照相比,细胞凋亡率显著升高,均具有统计学意义,说明miR-106b具有抑制生精细胞凋亡的作用;细胞周期检测结果显示,慢病毒感染 GC-1、GC-2 后,miR-106b mimics 组比 miR-106b inhibitor 组在 G0/G1 期细胞百分比显著降低、S期细胞百分比显著升高(P<0.05)。(5)靶基因预测及Real-time PCR 检测结果显示,GC-1、GC-2 中,STAT3 在 miR-106b mimics 组中的表达量显著低于其对照组(P<0.01),miR-106b inhibitor组与其对照相比,STAT3的表达量在GC-1中差异不显著,在GC-2中,STAT3在miR-106b inhibitor组中的表达量显著高于其对照组(P<0.1);在GC-1和GC-2中,SOCS3在miR-106b mimics组中的表达量均显著低于其对照组(P<0.05),而miR-106b inhibitor组与其对照相比,SOCS3的表达量在GC-1中差异不明显,在GC-2中,SOCS3在miR-106binhibitor组中的表达量显著高于其对照组(P<0.05);在GC-1中,miR-106b mimics组与其对照组相比,SMAD5的表达量具有下降趋势,miR-106b inhibitor组与其对照组相比,SMAD5的表达量有所升高,但是差异不显著(P>0.05),而在GC-2中,miR-106b mimics组与其对照组相比SMAD5的表达量上升,而在miR-106b inhibitor组及其对照组中SMAD5的表达量均低于miR-106b mimics组及其对照组,差异不显著(P>0.05)。结论:1.Trizol LS+miRNeasy Micro kit联合使用法(改良法)提纯的精浆miRNA质量好,能够满足后续实验要求。2.miR-106b在非梗阻性无精子症及弱精子症患者精浆中表达丰度显著低于正常对照组;弱精子症组中miR-106b的表达量显著高于非梗阻性无精子症组,差异均具有统计学意义。3.从出生后7天到35天的小鼠睾丸中,miR-106b的表达呈逐渐降低的趋势,35天后表达量趋于平稳。miR-106b能够促进GC-1、GC-2细胞增殖,抑制其凋亡,具有促进其细胞周期由G1期向S期过渡的趋势,抑制miR-106b的表达会引起GC-1、GC-2细胞周期阻滞在G1期。预测的靶基因STAT3、SOCS3与miR-106b的表达量呈现负相关的关系,初步判断其可能是miR-106b在生精细胞中的靶基因,但尚需进一步的实验验证。