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草酸普遍存在于动植物体和微生物中,越来越多的研究表明,它在植物适应生物和非生物胁迫中起重要作用,同时也与水果和蔬菜的品质有关,因此了解植物中草酸积累的调节机理既有理论意义也有应用价值。在生物体内,乙醇酸脱氢酶( Glycolatedehydrogense,GDH)催化乙醇酸氧化为乙醛酸或直接催化乙醇酸氧化为草酸;乙醛酸还原酶(Glyoxylate reductase,GR)主要是将乙醛酸还原为乙醇酸。本论文采用RNA干涉技术,研究水稻乙醇酸脱氢酶(OsGDH)和乙醛酸还原酶(OsGR)在调控草酸积累方面的作用,获得如下实验结果:
1.OsGDH和OsGR干涉载体的构建及遗传转化
以水稻叶片cDNA为模板,利用RT-PCR扩增得到OsGDH,OsGR1和OsGR2的部分特异片段,构建了组成型pYL-OsGDH-RNAi干涉载体和pYL-OsGR-RNAi双干涉载体。通过农杆菌介导法将其转入水稻愈伤组织,成功获得了转基因植株。
2.转基因植株的筛选和鉴定
OsGDH-RNAi T1代植株中的OsGDH在mRNA表达和蛋白水平均有明显下降,下调比例可达到了70%左右;OsGR-RNAi T1代植株中的OsGR在mRNA表达和酶活性水平分别降低了80%和65%左右。
3.OsGDH和OsGR与草酸积累的关系
OsGDH-RNAi T1代植株中出现了矮化植株,而OsGR-RNAi T1代植株中未观察到明显的表型差异。草酸含量测定结果显示:OsGDH-RNAi干涉植株叶片中的草酸含量随着干涉效果的增加而降低,降低幅度在15-25%;OsGR-RNAi干涉植株中草酸含量随着干涉效果的增加而升高,增加幅度达25%左右。
本研究结果进一步表明:乙醛酸是水稻中草酸合成的有效前体,OsGDH和OsGR可在调控水稻草酸积累中起作用。