【摘 要】
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微生物与动物之间的关系十分密切,它们能对宿主的生长发育、抵抗力、繁殖力以及寿命产生影响。在哺乳动物、鸟类、鱼类,甚至昆虫等无脊椎动物的体表以及肠道等组织之中,都发现有大量的微生物存在。随着动物微生物组学的快速发展,越来越多的动物宿主与共生微生物的相互作用的机制被揭示出来。鳞翅目昆虫作为昆虫纲动物的一员,其肠道内也存在着不同种类的微生物。然而,由于不同鳞翅目昆虫肠道微生物的群落结构存在较大差异,且肠
【基金项目】
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国家自然科学基金(31970483,31601906); 现代农业产业技术体系专项(CARS-18-ZJ0302); 浙江省蚕蜂资源利用与创新研究重点实验室项目(2020E10025);
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微生物与动物之间的关系十分密切,它们能对宿主的生长发育、抵抗力、繁殖力以及寿命产生影响。在哺乳动物、鸟类、鱼类,甚至昆虫等无脊椎动物的体表以及肠道等组织之中,都发现有大量的微生物存在。随着动物微生物组学的快速发展,越来越多的动物宿主与共生微生物的相互作用的机制被揭示出来。鳞翅目昆虫作为昆虫纲动物的一员,其肠道内也存在着不同种类的微生物。然而,由于不同鳞翅目昆虫肠道微生物的群落结构存在较大差异,且肠道中微生物的定植情况仍存在许多争议,因此对于此类昆虫肠道微生物的多样性研究仍需更多系统性的验证。鉴于微生物能够与宿主发挥一定程度的相互作用,通过它们调节昆虫的生长和代谢具备较高的可行性。为了将其应用于害虫防控和经济昆虫增产等领域,需要将微生物在鳞翅目昆虫肠道内的分布情况、动态变化、以及代谢能力做出较为全面和系统的归纳总结。本研究以鳞翅目模式昆虫家蚕(Bombyx mori)为主要研究对象,对其肠道中真菌和细菌在生命周期内的丰度变化和代谢活性进行了统计;利用鸟枪法宏基因组测序对这些微生物的代谢功能进行了初步探究,且与其他鳞翅目昆虫的微生物功能进行相似性比较;最后基于宏基因组的分析结果,对肠道微生物影响宿主农药抗性的机制进行了进一步探究。本研究通过对各龄期家蚕的肠道样品进行基于真菌转录间隔区域序列和细菌16S rRNA基因的微生物多样性测序。家蚕肠道的真菌DNA测序共获得571,980条序列。细菌的DNA测序获得1,448,300条序列;细菌RNA测序获得872,724条序列。微生物定量结果显示,家蚕肠道中真菌和细菌总量在生命周期内呈现先增加后降低的趋势。其中,幼虫发育至五龄时,肠道微生物总量达到峰值。微生物群落分析显示,家蚕肠道微生物的群落组成会随着幼虫发育产生变化,卵和低龄幼虫(1-2龄)的微生物组成与高龄幼虫(3-5龄)差异较大。此结果表明家蚕肠道微生物的群落结构与宿主所处的发育阶段有关。通过对细菌RNA的测序发现,家蚕肠道中部分微生物未观测到代谢活性,如Aureimonas属细菌,此类细菌可能为肠道中的过路细菌。其他丰度较高的微生物均发现在肠道内具有代谢活性,因此可能会与宿主发生相互作用。对P50和秋丰X白玉两个品种的家蚕肠道微生物进行鸟枪法宏基因组学测序后,注释结果中含有大量微生物代谢相关的基因。主要以碳水化合物、氨基酸和维生素等营养素代谢,以及可能与解毒相关的外源化合物代谢为主。本研究还调查了几种以桑叶为食的鳞翅目害虫(桑白毛虫(Acronicta major),桑毛虫(Euprotics similis)和桑螟(Glyphodes pyloalis))的肠道微生物组成,并与家蚕进行了对比。结果显示,肠道微生物的群落结构在鳞翅目昆虫种间的差异性较大,与之前的鳞翅目昆虫相关研究相似。结合家蚕和食桑昆虫的分析结果,本研究对9种具有不同生活习性和食性的鳞翅目昆虫的肠道微生物功能数据进行聚类分析。结果表明,鳞翅目昆虫肠道微生物功能可以按照其幼虫体型分为两大类:高体重型(末龄幼虫平均体重大于300 mg)和低体重型(末龄幼虫平均体重小于300 mg)。此结果预示着鳞翅目昆虫幼虫的肠道微生物功能可能能够通过幼虫的体型进行初步预测。通过使用不同种类的抗生素筛选发现,多粘菌素处理过的家蚕对农药毒死蜱的死亡率相比对照组显著提高。其中,嗜麦芽窄食单胞菌在抗生素处理后,其丰度显著降低,肠球菌(Enterococcus sp.)的占比显著提高。这些菌株接种无菌家蚕并通过酶活性、基因表达水平的检测发现,嗜麦芽窄食单胞菌能够降低饲喂毒死蜱家蚕的死亡率。但气相色谱和非靶向代谢组学分析结果证明,该细菌提高宿主抗性的机制并非直接降解肠道中的有毒化合物,而可能是通过提供必须氨基酸等营养物质,加强宿主体质等间接的方式达到提高宿主抗性的效果。本论文首次利用高通量测序技术将家蚕生命周期内肠道真菌和细菌的分布、动态变化进行了系统性分析,发现了家蚕肠道微生物在低龄幼虫和高龄幼虫之间群落结构的差异,并预测了家蚕肠道中存在代谢活力的微生物。此外,本论文首次完成了家蚕肠道微生物的鸟枪法宏基因组测序。结果显示肠道细菌对碳水化合物和氨基酸的代谢最为旺盛。通过与其它鳞翅目昆虫的横向对比,发现本研究所使用的9种具有不同食性的鳞翅目昆虫中,肠道微生物的代谢功能与宿主的体型存在相关性。最后,对宏基因组预测结果进行体内验证,发现了肠道微生物能够影响家蚕对农药的抗性,并解释了其可能的作用机制。利用上述研究结果,本研究构建了较为完整的家蚕肠道微生物与宿主的互作模型,为鳞翅目昆虫肠道微生物功能的研究提供了较为全面的基础数据,指出了肠道微生物在蚕桑产业应用的可能性。
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