高羊茅FaFT基因克隆、表达及生物学功能分析

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作为重要的牧草及草坪草种之一,高羊茅具有较高的经济开发价值,但它需要长日照才能进行花芽分化从而产生种子;目前高羊茅草种子主要从长时照的欧美地区进口,在我国暂时还不能有效生产种子。因此,深入研究高羊茅种子生产过程中光周期依赖性成花转变与花芽分化机制对于高羊茅草种本地化生产具有十分重要的意义。在植物开花诱导中,FLOWERING LOCUS T(FT)基因和FLOWERING LOCUS D(FD)基因起着重要作用。为揭示成花转变过程中高羊茅FaFT基因的功能,本研究以‘黔草1号’高羊茅为实验材料,运用同源克隆获得高羊茅FaFT基因的c DNA全长序列,并对该基因进行生物信息学分析和系统进化分析;再利用实时荧光定量PCR、酵母双杂、双分子荧光互补、遗传转化等技术来分析FaFT和Fa FD基因的表达特性和作用特点,主要研究结果如下:1.成功获得高羊茅FaFT基因序列和高羊茅FaFT基因的c DNA序列。高羊茅FaFT基因序列5045 bp,G+C含量为58.33%,含有2个内含子和3个外显子。FaFT基c DNA序列全长1 073 bp,开放阅读框为537 bp,位于154 bp~689 bp,编码178个氨基酸残基。其编码的蛋白为亲水性蛋白,含有α螺旋、无规则卷曲等丰富的二级结构,有一个保守的PEBP结构域。多重比对结果显示:高羊茅FaFT基因编码的氨基酸与黑麦草的同源性最高为98.84%,其次是二穗短柄草97.73%。进化树结果显示:高羊茅FaFT与黑麦草同处在一个小分支上,进化关系较近。2.高羊茅FaFT基因的表达有组织特异性,能维持一定的昼夜节律并受光周期的调控。无论是长日照还是短日照其表达量在叶中最高,其次是茎和根;长日照下的表达量高于短日照,但表达高峰出现的时间都在ZT8;长日照转连续光照和连续黑暗,表达高峰出现在ZT0,而短日照转连续光照和连续黑暗表达高峰出现在ZT4和ZT12;光照/黑暗循环模式下表达高峰出现在ZT4~ZT16。3.构建高羊茅FaFT基因与绿色荧光蛋白融合表达载体1300-GFP-FT转化烟草,激光共聚焦显微镜下检测融合载体的瞬时表达,结果显示高羊茅FaFT基因编码的蛋白定位在细胞核。酵母双杂交系统和双分子荧光互补证实FaFT与Fa FD存在相互作用。4.农杆菌介导转化拟南芥发现:LD下,FaFT基因过量表达转基因拟南芥植株表现出早花,比野生型平均开花时间提前约4d,比突变体植株提前约3d,功能补偿后的突变体atft能恢复野生型的开花表型,但atft本身无开花现象,一直停留在营养生长期;过表达FaFT基因拟南芥莲座叶数量比野生型、突变体要多。这表明FaFT基因促进拟南芥提前开花,恢复了atft的晚花表型。
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