胶质瘤是起源于神经胶质细胞的恶性肿瘤,根据胶质细胞的种类可分为星形胶质细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤等,其中星形胶质细胞瘤的发生率占全部胶质瘤的80%,严重威胁着患者的健康。临床上治疗方式主要是手术切除,辅以放疗和化疗,但疗效非常有限,患者5年生存期低于10%。这主要的原因是胶质瘤呈恶性浸润性生长,手术难以完全切除；而且胶质瘤对放、化疗均不敏感；此外,脑内还存在血脑屏障,从而极大限制了胶质瘤治疗的疗效。因此,寻求新的有效的胶质瘤治疗手段就显得尤为迫切。过继免疫治疗在肿瘤治疗领域被寄予厚望。它通过从肿瘤患者体内分离淋巴细胞,经体外的刺激扩增并赋予抗肿瘤特异性后,转输给患者以达到治疗目的。目前临床上针对急性白血病、慢性白血病、转移性黑色素瘤等多种肿瘤的治疗已经取得令人欣喜的疗效。然而,目前针对胶质瘤的过继免疫治疗尚未取得突破性进展,这主要是因为中枢神经系统具有特殊的生理结构和功能。首先,中枢神经系统是特殊的免疫静息区域,缺少专职抗原提呈细胞和淋巴循环系统,肿瘤发生时不能有效激活免疫细胞进而诱导抗肿瘤免疫应答；其次,胶质瘤通过多种机制促进肿瘤微环境形成,介导免疫抑制,分泌TGF-β2等抑制分子,促进髓样来源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)和调节性T细胞(regulatory Tcells, Treg)聚集,同时还诱导抑制性小胶质细胞的形成,严重削弱抗肿瘤免疫应答。因此,利用综合治疗手段打破胶质瘤诱导的免疫耐受成为胶质瘤过继免疫治疗成功的关键。Toll样受体(toll-like receptors, TLRs)是一种重要的模式识别受体,通过识别病原相关分子模式,在抗感染、介导炎症和抗肿瘤免疫应答中发挥关键作用。近期研究显示,TLRs激动剂不仅参与固有免疫应答,而且还直接介导适应性免疫应答,在多种病理状态下发挥相应的功能,这其中就包括恶性肿瘤。细菌脂蛋白(bacterial lipoprotein, BLP)是细菌细胞壁中的主要成分之一,是Toll样受体2(TLR2)的激动剂。我们的前期研究表明,BLP能有效增强T细胞抗肿瘤免疫应答,并显著削弱肿瘤介导的免疫抑制。那么,BLP是否能增强T细胞过继免疫治疗的效果呢?如果可以,其潜在的机制是什么呢?基于以上研究背景,我们以小鼠原位胶质瘤模型为基础,开展了BLP联合T细胞过继免疫治疗小鼠胶质瘤的研究。第一部分TLR2激动剂BLP增强T细胞过继免疫治疗胶质瘤疗效首先,我们利用小鼠脑立体定位仪,将小鼠胶质瘤细胞株GL261注射入尾状核,建立了小鼠原位胶质瘤模型,在荷瘤第5天过继转输肿瘤特异性T细胞,同时于第5、7、9和11天BLP腹腔注射。我们发现,荷瘤小鼠经过BLP联合T细胞过继免疫治疗后,与对照组相比生存期显著延长,并且33%的荷瘤小鼠获得长期存活。通过核磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)发现,经过BLP联合治疗后获得长期存活的荷瘤小鼠脑部未见肿瘤生长。而且,获得长期存活的荷瘤小鼠能够抵抗GL261胶质瘤细胞的再次攻击,证明BLP联合治疗使小鼠获得了长期的免疫保护,从而有效防止胶质瘤复发。BLP是TLR2的激动剂,那么TLR2信号通路是否参与了抗肿瘤免疫应答呢?因此,我们利用TLR2基因敲除(TLR2-/-)小鼠重复了以上BLP联合治疗实验。结果显示,在TLR2基因敲除小鼠中,BLP联合治疗的疗效完全缺失。因此,TLR2激动剂BLP可显著增强T细胞过继免疫治疗小鼠胶质瘤的疗效,并且是通过TLR2依赖的方式实现。进一步,我们检测到GL261细胞株有TLR2及其共受体TLR1的表达,为了解BLP是否直接影响GL261细胞的生物学表型和功能,我们使用不同浓度的BLP体外刺激GL261细胞,进行了细胞活力、凋亡水平、细胞因子分泌等检测。结果显示,GL261细胞的活力和凋亡水平均未明显改变,分泌IL-6和TNF-α的能力也未受到影响,因此BLP对GL261细胞无直接细胞毒性作用。由此我们可以得出结论,TLR2激动剂BLP增强T细胞过继免疫治疗小鼠胶质瘤的疗效不是通过对肿瘤细胞的直接作用实现的。第二部分TLR2激动剂BLP促进肿瘤特异性T细胞发挥抗肿瘤的效应通过第一部分研究,我们证实TLR2激动剂BLP联合T细胞过继免疫治疗展示了良好的抗胶质瘤效果,并且BLP不影响GL261细胞的生物学表型和功能,排除了BLP直接细胞毒性作用的可能。那么,BLP是否对过继转输的肿瘤特异性T细胞体内功能的维持和发挥有促进作用呢?因此在本部分的研究中,我们着重探究了BLP对肿瘤特异性T细胞体内功能的影响。首先,荷瘤小鼠经BLP联合T细胞过继免疫治疗后,我们分离了肿瘤浸润淋巴细胞,经流式细胞术分析发现,BLP联合治疗能显著增强肿瘤内淋巴细胞的浸润,尤其是T细胞的浸润。随后,利用GFP转基因小鼠来源的肿瘤特异性T细胞联合BLP治疗发现,BLP联合治疗后肿瘤内GFP+T细胞的浸润显著增多,脑冰冻切片的结果与之相符。进一步分析GFP+T细胞的亚群发现,CD8+T细胞的比例为92.8%,并且具有较强的IFN-y分泌能力。利用real-time PCR和ELISA检测IFN-γ诱导的趋化因子的表达发现,CXCL10转录和分泌水平的在肿瘤内均上调表达。进一步,利用CFSE标记的肿瘤特异性T细胞过继治疗发现,BLP联合治疗能显著促进肿瘤特异性T细胞体内增殖,并维持其长期存活。此外,在GFP+肿瘤特异性T细胞联合BLP治疗的荷瘤小鼠肿瘤内分离的GFP+T细胞,在体外具有更强的特异性杀伤能力。因此,基于以上实验结果我们认为,TLR2激动剂BLP促进过继转输的肿瘤特异性T细胞脑内的浸润和增殖、维持其体内存活时间并增强其抗肿瘤免疫效应,从而有效增强肿瘤特异性T细胞抗胶质瘤的应答。第三部分TLR2激动剂BLP改善MDSCs介导T细胞免疫抑制胶质瘤通过多种免疫耐受机制促进肿瘤免疫微环境的形成,其中MDSCs和Treg是维持肿瘤免疫抑制的主要细胞亚群。因此我们想进一步探究,BLP联合治疗的抗肿瘤效应是否得益于抑制性肿瘤免疫微环境的改善。首先,我们针对这两种抑制性细胞亚群进行了分析。结果显示,BLP联合治疗后,MDSCs在脾脏、血液中的积聚减少,在脑肿瘤局部的减少更加明显,而Treg比例无明显改变。CCL2是趋化MDSCs的重要趋化因子,进一步利用real-time PCR和ELISA分析发现,BLP联合治疗后CCL2在肿瘤局部表达水平显著降低。利用TLR2-/-小鼠分析发现,BLP联合治疗对MDSCs的抑制具有TLR2依赖性,而且TLR2敲除显著降低T细胞分泌IFN-y的能力。因此我们推测,BLP通过降低CCL2的表达减少MDSCs的脑内浸润,改善胶质瘤免疫微环境,从而增强T细胞过继免疫治疗胶质瘤的疗效。结论1.TLR2激动剂BLP增强T细胞过继免疫治疗胶质瘤的效果,且不依赖于BLP的直接细胞毒性作用；2.TLR2激动剂BLP增强肿瘤特异性T细胞的浸润、增殖和特异性杀伤功能,促进其发挥抗肿瘤效应；3.TLR2激动剂BLP通过降低肿瘤内CCL2表达抑制MDSCs的浸润,改善胶质瘤免疫微环境,从而促进肿瘤特异性T细胞发挥抗肿瘤免疫效应。