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繁殖障碍是造成母猪生产力水平低的一个重要原因，而由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的伪狂犬病(Pseudorabies,PR)则是引起母猪繁殖障碍的重要疫病因素之一。PRV感染妊娠母猪后，可引起母猪单核细胞病毒血症，降低母猪免疫力，并可通过胎盘屏障感染胎儿，导致母猪繁殖障碍，出现流产和死胎等临床症状。另外，PRV感染耐过猪会转为潜伏感染状态，长期携带病毒并排毒，成为新的传染源。自2011年中国出现毒力增强的变异毒株以来，该病在疫苗免疫的猪场不断发生，给发病猪场造成了严重的经济损失。增强机体细胞的抗病毒活性，有效抑制病毒的感染和在母猪体内的增殖，降低母猪流产率，是提高母猪生产力的主要措施之一。研究显示，维生素D的活性形式1，25(OH)2D3(VD3)，不仅在调节雌性动物母胎界面的免疫耐受，维持正常的妊娠方面起重要作用，而且还对一些病毒具有一定的抗病毒活性。然而，VD3是否具有增强宿主细胞抗PRV的活性，目前尚不清晰。本研究通过体内外实验，确定了VD3对PRV诱导小鼠流产的抑制作用，并对其分子机制进行了探讨。
(1)为了解由PRV引起的流产在母猪流产中所占的比重，本研究于2018年1月～2019年5月从河北省不同地区猪场收集的胎儿，采用PCR方法进行PRV检测，并将部分阳性样本进行了gE全基因的扩增和遗传变异分析。为进一步了解种猪群和商品猪群受PRV的影响程度，本研究采用ELISA检测方法对从河北省11个地市195个不同规模猪场采集的10，479份血清，进行了PRV病毒囊膜糖蛋白E(gE)抗体的检测。病原检测结果显示，204个流产胎儿中54个为PRV阳性，阳性率为26.47％;对扩增的8株PRV进行遗传进化分析，结果显示，河北省流行毒株均在第48位和第492位各存在1个天冬氨酸的插入，为变异毒株。血清学检测结果显示，所检测的河北省11个地市均存在不同程度的感染，血清样本gE抗体平均阳性率为50.05％;检测的195个猪场中，场群阳性率为82.56％，且存栏50～300头母猪的规模化猪场阳性率最高;不同阶段的猪群中，种猪群空怀母猪的阳性率最高，为73.75％;选择母猪gE抗体阳性率介于30～40％之间和60～70％之间的两类猪场各6个，进行流产率统计，结果显示，gE抗体阳性率高的猪场流产率明显高于gE抗体阳性率低的猪场。由以上结果可知河北省猪场PRV的感染较为普遍，同时，空怀母猪和流产胎儿的高阳性率提示PRV在引起母猪空怀和流产方面起着重要的作用。
(2)为探讨VD3对PRV诱导妊娠动物流产的影响。首先在小鼠妊娠的不同时间，采用颈背部皮下注射法，用不同剂量的PRV进行攻毒，确定PRV诱导小鼠流产的最适妊娠时间和最佳病毒用量。并用不同剂量的VD3预处理妊娠小鼠，然后接种PRV，分析感染后相关组织中PRV的效价及小鼠流产率和死亡率，以及VD3对小鼠子宫和卵巢病理变化的影响;结果显示用0.35mL1000TCID50PRV病毒剂量感染妊娠12d的小鼠，感染后实验小鼠出现较高的流产率。用300μg/kg的VD3预处理妊娠小鼠，可明显抑制PRV的增殖，减轻PRV感染引起子宫等组织的损伤，使小鼠流产率降低37.5％。VD3在小鼠体内具有抗PRV的活性。
(3)为了进一步探明VD3降低PRV引起小鼠流产的机制。本实验先使用不同浓度的VD3对PK-15细胞预处理，再用PRV感染细胞。PK-15细胞中PRV的效价用qPCR法检测，PRV对PK-15细胞的损伤情况用MTT法分析，以确定VD3在体外的抗PRV活性。然后使用不同剂量的PRV感染PK-15细胞，用Western blot方法对PK-15细胞中两种自噬相关蛋白LC3和p62在感染后的不同时间点的水平进行了分析，以确定PRV对细胞自噬的影响。并用PRV感染经自噬诱导剂雷帕霉素或自噬抑制剂3一甲基腺嘌呤（3-MA）预处理的PK-15细胞，以确定自噬对PRV复制的影响。之后用不同浓度的VD3处理PK-15细胞，然后再分别感染不等量PRV，并对感染后不同时间点细胞中LC3-Ⅱ和P62水平以及Ⅰ型干扰素(IFN-α)、促炎细胞因子（TNF-α和IL-6）的mRNA水平进行分析，以确定VD3是否能诱导PK-15细胞自噬，以及VD3对PRV的抑制作用是否与自噬及炎症反应等有关。结果显示，VD3在体外亦具有抗PRV活性，且VD3体外对PRV增殖的抑制程度与VD3的使用剂量有关，200nmol/L VD3能明显降低PK-15细胞中PRV的效价，减轻PRV对PK-15细胞的损伤。LC3-Ⅱ量随PRV感染后时间的变化而变化，PRV在感染早期诱导细胞自噬，而在感染后期，抑制宿主细胞的自噬。经雷帕霉素预处理的PK-15细胞，LC3-Ⅱ表达量明显升高，而PK-15细胞中PRV的效价则显著降低，经3-MA预处理的PK-15细胞，结果则与之相反，说明白噬可以抑制PRV在宿主细胞中的复制。VD3预处理能显著增加PRV感染细胞中LC3-Ⅱ的量和P62降解，降低PRV的效价，表明VD3可以诱导PK-15细胞自噬，且VD3抗PRV的作用与其诱导自噬有关。PRV感染能显著增加细胞IFN-α、TNF-α和IL-6的表达量。但VD3预处理，并没有使PRV感染细胞中IFN-α、TNF-α或IL-6的量增加。这些结果表明，VD3的抗PRV作用主要与其诱导的细胞自噬有关，而与I型干扰素或炎症反应无关。
综上所述，本研究首次证明VD3能有效抑制PRV增殖，降低PRV引起的流产率。细胞自噬有助于机体除清除感染的PRV，而VD3能有效诱导细胞自噬，且VD3对PRV的抑制作用与其诱导细胞自噬密切相关。
(1)为了解由PRV引起的流产在母猪流产中所占的比重，本研究于2018年1月～2019年5月从河北省不同地区猪场收集的胎儿，采用PCR方法进行PRV检测，并将部分阳性样本进行了gE全基因的扩增和遗传变异分析。为进一步了解种猪群和商品猪群受PRV的影响程度，本研究采用ELISA检测方法对从河北省11个地市195个不同规模猪场采集的10，479份血清，进行了PRV病毒囊膜糖蛋白E(gE)抗体的检测。病原检测结果显示，204个流产胎儿中54个为PRV阳性，阳性率为26.47％;对扩增的8株PRV进行遗传进化分析，结果显示，河北省流行毒株均在第48位和第492位各存在1个天冬氨酸的插入，为变异毒株。血清学检测结果显示，所检测的河北省11个地市均存在不同程度的感染，血清样本gE抗体平均阳性率为50.05％;检测的195个猪场中，场群阳性率为82.56％，且存栏50～300头母猪的规模化猪场阳性率最高;不同阶段的猪群中，种猪群空怀母猪的阳性率最高，为73.75％;选择母猪gE抗体阳性率介于30～40％之间和60～70％之间的两类猪场各6个，进行流产率统计，结果显示，gE抗体阳性率高的猪场流产率明显高于gE抗体阳性率低的猪场。由以上结果可知河北省猪场PRV的感染较为普遍，同时，空怀母猪和流产胎儿的高阳性率提示PRV在引起母猪空怀和流产方面起着重要的作用。
(2)为探讨VD3对PRV诱导妊娠动物流产的影响。首先在小鼠妊娠的不同时间，采用颈背部皮下注射法，用不同剂量的PRV进行攻毒，确定PRV诱导小鼠流产的最适妊娠时间和最佳病毒用量。并用不同剂量的VD3预处理妊娠小鼠，然后接种PRV，分析感染后相关组织中PRV的效价及小鼠流产率和死亡率，以及VD3对小鼠子宫和卵巢病理变化的影响;结果显示用0.35mL1000TCID50PRV病毒剂量感染妊娠12d的小鼠，感染后实验小鼠出现较高的流产率。用300μg/kg的VD3预处理妊娠小鼠，可明显抑制PRV的增殖，减轻PRV感染引起子宫等组织的损伤，使小鼠流产率降低37.5％。VD3在小鼠体内具有抗PRV的活性。
(3)为了进一步探明VD3降低PRV引起小鼠流产的机制。本实验先使用不同浓度的VD3对PK-15细胞预处理，再用PRV感染细胞。PK-15细胞中PRV的效价用qPCR法检测，PRV对PK-15细胞的损伤情况用MTT法分析，以确定VD3在体外的抗PRV活性。然后使用不同剂量的PRV感染PK-15细胞，用Western blot方法对PK-15细胞中两种自噬相关蛋白LC3和p62在感染后的不同时间点的水平进行了分析，以确定PRV对细胞自噬的影响。并用PRV感染经自噬诱导剂雷帕霉素或自噬抑制剂3一甲基腺嘌呤（3-MA）预处理的PK-15细胞，以确定自噬对PRV复制的影响。之后用不同浓度的VD3处理PK-15细胞，然后再分别感染不等量PRV，并对感染后不同时间点细胞中LC3-Ⅱ和P62水平以及Ⅰ型干扰素(IFN-α)、促炎细胞因子（TNF-α和IL-6）的mRNA水平进行分析，以确定VD3是否能诱导PK-15细胞自噬，以及VD3对PRV的抑制作用是否与自噬及炎症反应等有关。结果显示，VD3在体外亦具有抗PRV活性，且VD3体外对PRV增殖的抑制程度与VD3的使用剂量有关，200nmol/L VD3能明显降低PK-15细胞中PRV的效价，减轻PRV对PK-15细胞的损伤。LC3-Ⅱ量随PRV感染后时间的变化而变化，PRV在感染早期诱导细胞自噬，而在感染后期，抑制宿主细胞的自噬。经雷帕霉素预处理的PK-15细胞，LC3-Ⅱ表达量明显升高，而PK-15细胞中PRV的效价则显著降低，经3-MA预处理的PK-15细胞，结果则与之相反，说明白噬可以抑制PRV在宿主细胞中的复制。VD3预处理能显著增加PRV感染细胞中LC3-Ⅱ的量和P62降解，降低PRV的效价，表明VD3可以诱导PK-15细胞自噬，且VD3抗PRV的作用与其诱导自噬有关。PRV感染能显著增加细胞IFN-α、TNF-α和IL-6的表达量。但VD3预处理，并没有使PRV感染细胞中IFN-α、TNF-α或IL-6的量增加。这些结果表明，VD3的抗PRV作用主要与其诱导的细胞自噬有关，而与I型干扰素或炎症反应无关。
综上所述，本研究首次证明VD3能有效抑制PRV增殖，降低PRV引起的流产率。细胞自噬有助于机体除清除感染的PRV，而VD3能有效诱导细胞自噬，且VD3对PRV的抑制作用与其诱导细胞自噬密切相关。