女贞子为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实,具有滋补肝肾、明目乌发的功效。临床上,多以其酒蒸品入药,酒蒸后,其补肝肾、强筋骨功效增强。然而其炮制前后的化学成分、抗骨质疏松的药效物质基础、量效关系和作用机理尚未得到深入研究,2020版骨质疏松诊疗指南已将其用于治疗原发性骨质疏松。大量临床研究表明,骨质疏松常伴随着铁过载,有效的降低铁过载是治疗骨质疏松的热点和难点。本文拟通过研究女贞子酒制前后的特征性成分转化及其对铁过载骨质疏松的治疗效果,阐述酒女贞子抗铁过载骨质疏松的增效机理。先后建立了女贞子、酒女贞子指纹图谱分析方法;采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q-Orbitrap-MS/MS）定性分析女贞子酒蒸前后含有的化学成分。通过化学模式识别方法来确定与女贞子酒蒸相关的化学标志物。随后运用高效液相色谱（HPLC）定量分析不同酒蒸时间（2h,4h,6h,8h,10h,12h）的女贞子中化学标志物的含量,阐述女贞子在酒蒸过程中化学成分整体转化机制。通过网络药理学和分子对接探讨酒女贞子治疗铁过载骨质疏松的潜在作用机制。采用药动学-药效学（PK-PD）结合模型研究酒女贞子治疗铁过载骨质疏松的药效物质基础和量-效关系。采用斑马鱼、SD大鼠两种动物建立铁过载骨质疏松模型,评估酒女贞子的治疗作用效果,最终阐明酒女贞子治疗铁过载骨质疏松的增效机理。第一章综述本章首先综述了原发性骨质疏松及其风险因素铁过载,介绍铁过载调控机制,阐述机体如何调节铁代谢;其次介绍了铁过载对骨代谢的影响、女贞子在抗骨质疏松方面的研究进展及女贞子酒蒸增效概述,随后概括了网络药理学在中药作用机理研究中的概况和PK-PD结合模型在中药量-效关系研究中的进展;最后提出本论文的研究目的和研究意义。第二章女贞子HPLC指纹图谱建立女贞子、酒女贞子的HPLC指纹图谱,采用化学计量学方法-聚类分析和主成分分析（PCA）联合相似度计算对女贞子、酒女贞子进行质量控制。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对15批女贞子、酒女贞子的HPLC色谱图进行分析,计算相似度,运用聚类分析、PCA对其进行模式识别研究。建立了15批女贞子及酒女贞子的HPLC指纹图谱,相似度均在0.9-1.0,通过聚类分析和PCA可以完全将女贞子和酒女贞子区分开来。建立的指纹图谱方法稳定可靠,可为女贞子、酒女贞子质量控制提供方法依据,同时结合化学模式识别研究有助于女贞子炮制前后整体质量控制及质量评价。第三章女贞子炮制前后化学成分转化机制及其质量标志物挖掘探讨女贞子酒蒸前后化学成分的变化并筛查与女贞子酒蒸相关的化学标志物。采用UPLC-Q-Orbitrap-MS定性分析女贞子酒蒸前后含有的化学成分。通过化学模式识别方法-正交偏最小二乘法-判别分析（OPLC-DA）来确定与女贞子酒蒸相关的化学标志物。随后运用HPLC定量分析不同酒蒸时间（0h,2h,4h,6h,8h,10h,12h,16h,20h和24h）的女贞子中化学标志物的含量,阐述女贞子在酒蒸过程中化学成分整体转化过程。共解析126个化合物,其中58个环烯醚萜类、25个萜类、30个苯乙醇类、7个黄酮类和6个其他类化合物。化学计量学方法揭示20个与女贞子酒蒸相关的化学标志物,包括Ligustrohemiacetal B、特女贞苷、橄榄苦苷苷元、木犀草苷、女贞苷、对羟基苯乙基-7-β-D-葡萄糖苷榄香酸酯、19α-羟基-3-乙酰-熊果酸、橄榄苦甘酸、毛蕊花糖苷、10-羟基油苷二甲酯、松果菊苷、橄榄苦苷、7-酮连接蛋白、红景天苷、3,4-二羟基苯乙基-β-D-葡萄糖、女贞酸、G13、女贞子酸、10-羟基橄榄苦苷和油苷-11-甲酯。OPLS-DA结果表明,女贞子酒蒸前后具有显著差异。HPLC定量结果表明,随着酒蒸时间的延长,5-羟甲基糠醛、羟基酪醇、红景天苷的含量显著增加（P＜0.05）,特女贞苷的含量在显著下降（P＜0.05）。化学成分变化轨迹图展现了女贞子酒蒸过程中,化学成分的整体变化。除此之外,液相定量结果表明,红景天苷的增加量中,77%由特女贞苷转化而来,剩余的23%由同样具有红景天苷母核结构的女贞次苷、oleonuezhenide、G13等转化而来。第四章酒女贞子调控铁过载抗骨质疏松网络药理学研究联合网络药理学和分子对接来研究酒女贞子治疗铁过载骨质疏松症的潜在作用机制。从TCMSP数据库中获得女贞子的生物活性成分及其相应的蛋白靶点。通过检索Gene Cards、OMIM、Pharm Gkb、TTD和Drug Bank数据库,总结了与铁过载、骨质疏松相关的靶点。识别女贞子和铁过载、骨质疏松的共有靶点,利用Cytoscape软件对共有靶基因分析处理获得核心靶基因。通过R语言对药物和疾病共有靶基因进行GO和KEGG分析。最后,用vina进行成分和靶点之间的分子对接。从女贞子中筛选得到20个主要活性成分和227个潜在治疗靶基因,包括10个核心基因（BMP6、BMPR1A、STAT3、SMAD4、ESR1、CTNNB1、TP53、AKT1、SMAD3和RUNX2）。KEGG通路分析表明,女贞子治疗铁过载诱导的骨质疏松的靶点主要集中在TGF-beta、AGE-RAGE、Pancreatic cancer、Hepatitis B和Colorectal cancer等信号通路上。分子对接结果表明,女贞子中的活性成分与核心靶基因编码的大分子靶蛋白普遍具有良好的结合亲和力。通过网络药理学初步筛选得到女贞子治疗铁过载骨质疏松的潜在作用机制,主要通过调节TGF-beta信号通路治疗铁过载骨质疏松。第五章PK-PD结合模型探讨酒女贞子调控铁过载抗骨质疏松的药效物质基础及量-效关系建立酒女贞子的药代动力学（PK）-药效动力学（PD）模型。采用双侧卵巢切除造雌激素缺失状态下铁过载骨质疏松大鼠模型,灌胃高（4.5 g/kg）、中（1.5g/kg）、低（0.4 g/kg）三个剂量的酒女贞子,分别于0,0.083,0.17,0.25,0.5,0.75,1,2,4,8,12和24h眼眶取血,采用UPLC-MS/MS检测不同时间点血浆样本中红景天苷、羟基酪醇、酪醇和齐墩果酸的含量,获得药时曲线;ELISA试剂盒测不同时间点血浆样本中Fer、ALP、OGN、OPG和Hep的水平,得时效曲线;采用Win Nolin软件进行PK分析,获得PK参数,随后判断房室模型进行PD分析,最后对PK,PD拟合。建立了适用于分析铁过载骨质疏松模型大鼠血浆中羟基酪醇、红景天苷、酪醇和齐墩果酸浓度的UPLC-MS/MS法,运用Win Nolin软件建立了PK-PD模型,在该模型下可以根据羟基酪醇、红景天苷、酪醇和齐墩果酸的血药浓度计算对应药效值,也可根据效应值标反推血药浓度。第六章酒女贞子调控铁过载抗骨质疏松增效机理研究本章节采用斑马鱼、SD大鼠两种动物建立铁过载骨质疏松模型,评估女贞子、酒女贞子的治疗作用效果。利用斑马鱼模型评价酒女贞子对柠檬酸铁胺诱导的骨形成抑制的逆转作用。采用茜素红染色结合图像定量的方法研究了女贞子对骨矿化面积和累积光密度的影响。使用Etho Vision XT软件监测斑马鱼的运动情况。使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定斑马鱼骨矿化元素（Mg、K、Ca、Fe和Zn）的含量。斑马鱼实验结果表明,与模型组相比,女贞子生品与酒女贞子组斑马鱼的骨矿化面积（AMB）、累计光密度（COD）和骨矿化元素（尤其是Ca）的含量均显著性的增加（P＜0.05）;与生品相比,酒女贞组上述各项指标均具有显著性差异,其中,头骨染色面积增加了87932.28±336.91,累积光密度增加了32895.17±128.56,Ca元素的含量增加了37.61±1.23;此外,行为学数据证明无论是移动速度、移动距离抑或是移动频率,酒女贞组都有了一定程度地改善。首先采用双侧卵巢切除方法建立大鼠铁过载骨质疏松模型,恢复性饲养1个月,随机分组:包括假手术组（0.9%Na Cl溶液）,模型组（0.9%Na Cl溶液）,女贞子高剂量组（700 mg/kg女贞子）,女贞子低剂量组（350 mg/kg女贞子）,酒女贞子高剂量组（700 mg/kg酒女贞子）,酒女贞低剂量组（350 mg/kg酒女贞子）,雌二醇组（50μg/kg雌二醇）和去铁胺组（2 mg/kg去铁胺）。灌胃女贞子、酒女贞子治疗两个月。试剂盒测定骨转换血清因子血清铁蛋白（Fer）,碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OGN）、骨保护素（OPG）和铁调素（Hep）的含量。利用MicroCT测定各组大鼠股骨骨小梁参数;采用WB和RT-PCR测定各组大鼠肝脏中BMP-6,Hep,p-SMAD1/5和SMAD4的基因蛋白表达。结果表明,与假手术组相比,模型组大鼠血清中Fer的含量显著增加（P＜0.05）,表明卵巢切除后,雌激素缺失状态下铁过载诱导的骨质疏松模型造模成功;药物治疗后,大鼠血清中Fer的含量显著降低（p＜0.05）,说明女贞子、酒女贞子的干预能显著治疗铁过载并具有剂量依赖性。此外,与假手术组相比,模型组骨形成相关的标志物ALP,OPG和OGN的含量降低,而女贞子、酒女贞子的治疗显著增加了ALP,OPG和OGN的含量。Micro-CT结果表明,与假手术组相比,模型组大鼠骨密度（BMD）,骨小梁厚度（Tb.Th）,骨小梁数目（Tb.N）和骨体积分数（BV/TV）均显著性下降（P＜0.05）,而骨小梁分离度（Tb.Sp）显著性增加,表明骨微结构受到损坏,骨质疏松严重,女贞子、酒女贞子组的结果表明,女贞子,酒女贞子能显著性的改善骨微结构,具体表现为BMD、Tb.Th、Tb.N和BV/TV增加,Tb.Sp减少。WB和RT-PCR的实验结果表明,BMP-6,Hep,p-SMAD1/5和SMAD4的蛋白表达显著性增加。这些实验结果说明,铁过载会抑制骨形成,诱导骨质疏松,而酒女贞子对其具有治疗效果。其作用机理可能是通过激活BMP-SMAD信号通路。第七章结论与展望基于网络药理学和PK-PD结合模型最终阐明了酒女贞子抗骨质疏松增效机理。在本研究中通过最后的药效实验（斑马鱼实验、大鼠实验）证明酒女贞子治疗铁过载骨质疏松作用强于女贞子,证实了酒蒸增效,结合第五章的PK-PD结合模型,提示酒女贞子可能通过铁过载骨质疏松大鼠中红景天苷、羟基酪醇、酪醇和齐墩果酸的代谢增加来发挥抗铁过载骨质疏松作用。本研究发现表明红景天苷、羟基酪醇、酪醇和齐墩果酸是药效物质基础,作用机制是激活BMP-SMAD信号通路,促进铁调素的表达,下调机体铁过载最终发挥抗骨质疏松作用效果。