研究背景心脏骤停（Cardiac arrest,CA）是指各种原因引起的心脏机械活动的突然停止,是全世界成人死亡的主要原因。据统计,全球每年约有800-900万人发生心脏骤停。而研究显示我国每年约有55万人发生心脏骤停。虽然近半个世纪以来,心肺复苏术（Cardiopulmonary resuscitation,CPR）的不断发展显著提高了 CA患者恢复自主循环（Return of spontaneous circulation,ROSC）的成功率,但ROSC后患者的生存率依然很低。因此,如何改善CA/CPR患者恢复ROSC后的生存率已成为目前亟待解决的重大医疗卫生问题。心脏骤停后综合征（Post-cardiac arrest syndrome,PCAS）是指心脏骤停患者复苏后发生的一系列症状。CA复苏患者的全身缺血和再灌注导致了心脏骤停后综合征,这种综合征可能在恢复自主循环后的几天或几周内发生,主要包括脑损伤、心肌功能障碍、全身缺血/再灌注损伤和原发性疾病。而心脏骤停后心功能障碍是复苏后高死亡率的一个关键原因。研究表明,2/3的复苏患者出现心脏骤停后心肌功能障碍（PCAMD）,约1/3的CA患者在ROSC后的24h内死于PCAMD。因此,改善PCAMD是提高CA患者预后的一个关键环节。研究显示,窒息缺氧、缺血/再灌注损伤、复苏时的药物与机械损害是造成PCAS的主要发生机制。迄今为止,已经证明有几种策略可以减少CA后的心肌功能障碍。其中,远端缺血适应（RIC）已成为最有前途的策略之一。RIC是多种缺血性疾病的安全治疗策略,是利用远端器官的短暂缺血/再灌注,从而激活保护性信号通路,最终达到保护心肌的目的。以上方案由复杂的信号级联进行参与,包括肌膜受体激活、细胞内酶激活、线粒体结构稳定以及死亡信号的抑制。目前,远端缺血适应已成功应用于急性心肌梗死后进行冠状动脉血运重建和再灌注的患者。但远端信号从外周传递到心脏的确切机制尚不清楚。先前的研究表明,由肢体短暂缺血发作引起的RIC可显着改善心肺复苏（CPR）后的心肌功能和存活率。然而,在CPR期间进行四五个周期的RIC很难在临床环境中实施,这给急诊医师带来了沉重的负担。因此,探索更省时、更有效的RIC替代方案显得尤为重要。最新研究显示,RIC在CA/CPR后的心肌保护和脑保护中发挥了重要作用。目前关于RIC改善PCAMD的具体的作用机制未被揭示。外泌体（exosome）是由各种细胞分泌的膜结合囊泡,平均直径约100 nm,起源于内体系统,存在于体液中,参与多种病理生理过程。外泌体目前被认为是细胞间通讯的重要机制,可携带蛋白质、脂质和遗传物质在细胞间进行交换,参与心血管疾病、免疫反应、妊娠、中枢系统疾病和癌症进展。其在调节复杂细胞内通路中发挥的作用使其在多种疾病的治疗中具有潜在应用价值。并且,exosome对心血管疾病的缺血/再灌注损伤有重要保护作用。因此我们推测,exosome对PCAMD中的心肌损伤也存在治疗作用。因此,结合当前国内外研究进展,本课题拟利用大鼠心脏骤停模型以及原代心肌细胞缺氧复氧（Hypoxia-reoxygenation,H/R）模型探讨RIC诱导产生的外泌体（RIC-exosome）对PCAMD的治疗作用,为临床治疗PCAMD提供新的方法和思路。研究目的本课题的主要目的在于:1.明确RIC-exosome对PCAMD的治疗作用。2.明确RIC-exosome中发挥心肌保护作用的确切机制。3.探究miR-542-5p发挥抗心肌凋亡作用的具体机制。研究方法我们通过窒息法构建大鼠CA/CPR模型,探究RIC诱导产生的外泌体对PCAMD大鼠心功能、生存率以及心肌损伤程度的影响。通过提取原代心肌细胞并进行缺氧/复氧（H/R）刺激,观察RIC-exosome对心肌细胞损伤的作用,并通过exosome抑制剂排除了非exosome因素的影响。随后我们通过miRNA芯片技术筛选了 RIC-exosome特异性表达的差异miRNA,并对其进行了功能学验证。最后,我们使用多种生物学技术,探究了 miRNA调控下游靶蛋白,发挥心肌保护作用的具体机制。（一）动物实验1.大鼠远端缺血适应模型建立大鼠戊巴比妥麻醉,双下肢用弹力带束紧,5分钟缺血+5分钟再灌作为一个循环,共进行4个循环。RIC结束后,大鼠用抗凝管心尖取血,全血离心取大鼠血浆进行exosome分离。2.血浆exosome分离大鼠 RIC 后取全血,1600 g*20 min 取血浆,随后 2000g*30 min、12000 g*45 min去除细胞碎片,取上清过220μm滤网。余下上清进行110000 g*90 min超速离心取沉淀;沉淀在PBS中重悬后再次进行110000 g*70 min超速离心,沉淀即为exosome。将exosome重悬于PBS中,经醋酸双氧铀负染后在透射电镜下观察其形态,使用Western blot检测其标志性蛋白marker表达,并进行粒径分析检测（NTA）,从而对exosome进行多重鉴定。3.大鼠心脏骤停模型的建立雄性Wistar大鼠,体重400-450g,异氟烷麻醉,给予气管插管呼吸机辅助通气,股动脉、股静脉置管。使用PowerLab数据采集和分析系统记录血压和心电图。关闭呼吸机、夹闭气管插管使大鼠窒息,当MAP＜30mmHg时定义为心脏骤停。窒息8.5分钟后,启动呼吸机,给予人工胸外按压（200次/分钟）,肾上腺素注射（CPR启动1分钟后给药,2 μg/100g,每隔3分钟给药一次）。恢复窦性心率,MAP≥60mmHg且持续10分钟及以上定义为ROSC。达到ROSC者继续实验。若心肺复苏持续10分钟,大鼠仍不能恢复自主循环,则认为复苏失败。4.分组及给药（1）动物实验1:验证RIC-exosome对PCAMD的改善作用。大鼠麻醉后随机分为4组,每组以ROSC后4 h、24 h、7d时间点再分为3个亚组,4 h亚组每组5只大鼠,24 h亚组每组7只大鼠,7 d亚组每组10只大鼠。分组:1)CA/CPR 组:大鼠 ROSC 后静脉注射 500μL 的 PBS;2)RIC+CA/CPR组:大鼠RIC后进行CA/CPR;3)CA/CPR+RIC-exosome组:大鼠ROSC后静脉注射500 μ L 的 RIC-exosome;4)CA/CPR+Ctrl-exosome 组:大鼠 ROSC 后静脉注射 500μL的Ctrl-exosome。4h亚组ROSC后4h处死取材,24h亚组ROSC后24h处死取材,7 d亚组观察ROSC 1-4 h的心功能和7 d生存情况。（2）动物实验2:抑制exosome分泌阻滞RIC的心肌保护作用。大鼠随机分为2组,依据分组隔天一次、一周4次腹腔给药。随后大鼠进行RIC+CA/CPR,ROSC后每组以ROSC后4 h、7d时间点再分为2个亚组,4 h亚组每组5只大鼠,7 d亚组每组10只大鼠。分组:1)GW4869+RIC+CA/CPR组:大鼠提前一周腹腔注射GW4869,随后进行RIC+CA/CPR;2)Vehicle+RIC+CA/CPR组:大鼠提前一周腹腔注射DMSO,随后进行RIC+CA/CPR。4 h亚组ROSC后4 h处死取材,7 d亚组观察ROSC 1-4 h的心功能和7 d生存情况。（3）动物实验3:验证过表达miR-542-5p对PCAMD的改善作用。大鼠麻醉后随机分为2组,每组以ROSC后4 h、7d时间点再分为2个亚组,4 h亚组每组5只大鼠,7 d亚组每组10只大鼠。分组:1)AAV9-miR-542-5p+CA/CPR 组:大鼠尾静脉注射 AAV9-miR-542-5p 心肌特异性过表达病毒后1个月,进行CA/CPR;2)AAV9-Scramble+CA/CPR组:大鼠尾静脉注射AAV9-Scramble心肌特异性对照病毒后1个月,进行CA/CPR。4 h亚组ROSC后4 h处死取材,7 d亚组观察ROSC 1-4 h的心功能和7 d生存情况。（4）动物实验4:验证抑制miR-542-5p可逆转RIC-exosome对PCAMD的改善作用。大鼠麻醉后随机分为2组,每组以ROSC后4 h、7d时间点再分为2个亚组,4 h亚组每组5只大鼠,7 d亚组每组10只大鼠。分组:1)CA/CPR+RIC-exosome+miR-542-5p antagomir 组:大鼠 ROSC 后静脉注射RIC-exosome+miR-542-5p 抑制剂;2)CA/CPR+RIC-exosome+NC antagomir 组:大鼠ROSC后静脉注射RIC-exosome+对照antagomir。4 h亚组ROSC后4 h处死取材,24 h亚组ROSC后24 h处死取材,7 d亚组观察ROSC 1-4 h的心功能和7 d生存情况。5.心率及平均动脉压监测心电图监测心率,左侧股动脉置管监测平均动脉压。6.心功能评价利用心脏超声图像,计算大鼠左室射血分数（Left ventricular ejection fraction,LVEF）以及心输出量（Cardiac output,CO）。7.心肌细胞凋亡检测ROSC后4 h处死大鼠,取左心室行冰冻切片,通过脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺 口末端标记法（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL）检测心肌凋亡情况。8.心肌酶水平检测ROSC后4 h时,取全血于EDTA抗凝采血管中,4℃以1400g离心15分钟,收集血清。用ELISA法检测血清中cTnT、CK-MB、LDH水平。9.心肌细胞线粒体形态电镜观察ROSC后4 h时大鼠给予安乐死,取左心室用戊二醇固定、切片、染色,利用透射电镜观察心肌细胞线粒体形态,使用Flameng评分对线粒体形态进行半定量分析。10.炎症因子检测ROSC后4 h处死大鼠,取血清和心肌组织,利用ELISA法检测循环中白介素-1 β（IL-1β）、白介素-10（IL-10）水平。11.心脏组织蛋白检测ROSC后4 h处死大鼠,取左心室匀浆提取总蛋白。取20 μg组织蛋白,利用Western blot检测心肌内蛋白表达。12.观察7 d生存率大鼠ROSC 4 h后,拔除气管插管及股动静脉置管,并缝合创口。返回笼中密切观察,记录大鼠存活情况。13.生物信息学分析将RIC-exosome与Ctrl-exosome进行miRNA芯片分析,对比两组间的miRNA差异表达,并运用qPCR对相关差异表达miRNA进行验证。14.统计分析计量资料数据符合正态分布且方差齐时,采用均数±标准误（Means±SEM）表示,并使用t检验统计,不符合正态分布或符合正态分布但方差不齐时,采用中位数（第二四分位数,第三四分位数）表示,并使用Mann-Whitney检验,应用GraphPad Prism 8软件对数据进行统计学分析,包括正态分布检验、方差齐性检验、t检验和Mann-Whitney检验等,P＜0.05被视为具有统计学差异。（二）细胞实验1.原代心肌细胞H/R模型的建立1-3天龄的Wistar大乳鼠,取心脏剪碎,洗净残留的血细胞。使用胶原酶Ⅱ 37℃消化剪碎的心肌组织1小时,更换胶原酶Ⅱ后再次消化1小时。留取两次上清离心后得到细胞沉淀。沉淀用培养基重悬后过100μ m筛网,随后将上清置于细胞培养瓶中差速贴壁90分钟,剩余上清中即为心肌细胞,贴壁的为成纤维细胞。将心肌细胞用细胞计数板计数后,以1*106密度种于细胞培养瓶中,进行后续试验。将正常环境培养（DMEM低糖培养基,95%O2+5%CO2）的原代心肌细胞置于无糖低氧环境（DMEM无糖培养基,1%O2+94%N2+5%CO2）中12 h后,再将细胞置于正常环境中培养4 h,模拟复苏后再灌注。2.分组及给药（1）细胞实验1:验证RIC-exosome对PCAMD的改善作用。细胞分为4组:1)Normoxia组:始终正常环境培养;2)H/R+Vehicle组:细胞无糖低氧12h,加入100 μLPBS,继续正常环境培养4 h;3)H/R+RIC-exosome组:细胞无糖低氧12 h,加入100μL RIC-exosome,继续正常环境培养4 h;4)H/R+Ctrl-exosome组:细胞无糖低氧12 h,加入100 μ L Ctrl-exosome,继续正常环境培养4 h。（2）细胞实验2:抑制exosome分泌阻滞RIC的心肌保护作用。大鼠随机分为2组,分别腹腔注射GW4869和DMSO（一周4次）,RIC后取血浆分离exosome。细胞分为2组:1)H/R+RIC-exosomeGW4869组:细胞无糖低氧 12 h,加入RIC-exosomeGW4869,继续正常环境培养 4 h;2)H/R+RIC-exosomeVehicle 组:细胞无糖低氧12 h,加入RIC-exosomeVehicle,继续正常环境培养4h。（3）细胞实验3:验证miR-542-5p对H/R刺激的心肌细胞损伤的保护作用。细胞分为 4 组:1)miR-542-5p mimic+H/R:细胞提前 48 h 转染 miR-542-5p mimic,随后无糖低氧12 h,继续正常环境培养4 h;2)NC mimic+H/R:细胞提前48 h转染NC mimic,随后无糖低氧 12 h,继续正常环境培养 4 h;3)miR-542-5p inhibitor+H/R+RIC-exosome:细胞提前48 h转染miR-542-5p inhibitor。加入RIC-exosome后,细胞无糖低氧12 h,继续正常环境培养4 h;4)NC inhibitor+H/R+RIC-exosome:细胞提前48 h转染NC inhibitor。加入RIC-exosome后,细胞无糖低氧12 h,继续正常环境培养4 h。（4）细胞实验4:IGF2R过表达可逆转miR-542-5p的心肌保护作用。细胞分为3组:1)空载体组+NC mimic+H/R组:细胞提前48 h转染质粒空载体和NC mimic,随后无糖低氧培养12 h,正常环境培养4h;2)空载体组+miR-542-5p mimic+H/R组:细胞提前48 h转染质粒空载体和miR-542-5pmimic,随后无糖低氧培养12 h,正常环境培养4 h;3)IGF2R过表达质粒+miR-542-5p mimic+H/R组:细胞提前48 h转染IGF2R过表达质粒和miR-542-5p mimic,随后无糖低氧培养12 h,正常环境培养4 h。3.心肌细胞凋亡检测利用流式细胞术检测4组细胞凋亡情况。4.心肌细胞蛋白检测处理后的心肌细胞提取蛋白后,利用Western blot检测原代心肌细胞蛋白表达。5.心肌细胞活性检测心肌细胞以适当密度种于96孔板内,利用CCK8对心肌细胞活性进行检测。6.心肌细胞损伤程度检测用ELISA方法检测心肌细胞LDH活性,从而反映心肌细胞损伤程度。7.双荧光素酶报告基因实验通过生物信息学工具对miRNA-542-5p与IGF2R的结合位点进行预测,并构建IGF2R结合位点突变质粒,以萤火虫荧光素酶为报告基因,以海肾荧光素酶为内参基因。HEK293T 细胞分别按照（1）IGF2R-WT（wild type）质粒+NC mimic,（2）IGF2R-WT质粒+miRNA-542-5p mimic,（3）IGF2R-MUT（mutant）质粒+NC mimic,（4）IGF2R-MUT质粒+miRNA-542-5p mimic分组进行转染,利用荧光酶标仪观察荧光强度。8.统计分析同动物实验步骤。研究结果1.动物实验的基线和模型数据在4个动物实验中,动物基线和模型数据与对照组相比没有显著差异,包括体重、心率、MAP、CO、EF、心脏骤停持续时间、CPR持续时间和ROSC（%）。2.RIC明显上调了血浆中的exosome含量Western blot 检测 exosome 标志性蛋白 marker CD9、CD63 和 TSG101,结果显示 RIC显著增加血浆内exosome含量。NTA粒径分析也显示等量血浆中,接受RIC刺激的大鼠血浆内exosome含量更高。3.PKH26标记的exosome能够被心肌细胞摄取PKH26标记的exosome显示为红色荧光。荧光结果显示,外泌体在注射后1 h即可被心肌组织摄取,在24 h达高峰,72 h略有下降。4.RIC-exosome能够有效改善心脏骤停后心功能障碍心功能结果示,与CA/CPR组相比,CA/CPR+RIC-exosome组大鼠在ROSC后1-4 h的心功能有明显改善。5.RIC-exosome 提高 ROSC 后 7 d 生存率生存分析提示,RIC-exosome明显提高了 CA/CPR大鼠ROSC后7 d生存率。6.RIC-exosome降低了 CA/CPR后心肌酶水平在动物实验1中,ELISA结果显示,CA/CPR组大鼠血清中cTnT、CK-MB、LDH水平在ROSC后24 h显著升高。而CA/CPR+RIC-exosome组大鼠血清中cTnT、CK-MB、LDH水平在ROSC后24 h明显低于CA/CPR组。7.RIC-exosome减轻了心脏骤停后心肌细胞凋亡在动物实验1中,TUNEL结果显示,CA/CPR+RIC-exosome组大鼠心肌细胞的凋亡水平较CA/CPR组显著减少。细胞实验中,RIC-exosome给药后明显减少了 H/R损伤导致的原代心肌细胞凋亡。Western blot结果表明,与Normoxia组相比,在H/R后4h后Cleaved caspase-3表达增多,RIC-exosome给药显著抑制了 H/R造成的凋亡。8.RIC-exosome未能减轻心脏骤停后心肌线粒体结构损伤和炎症水平动物实验1中,心肌组织电镜结果提示,CA/CPR组大鼠心肌细胞线粒体结构在ROSC后4 h出现较多破坏,如线粒体肿胀、嵴排列紊乱或断裂等。随后,我们使用Flameng评分对线粒体形态进行了半定量分析,发现ROSC后4h线粒体明显受损,而CA/CPR+RIC-exosome组大鼠心肌细胞线粒体结构损伤程度在ROSC后4 h与CA/CPR组无显著差异。ELISA结果显示,CA/CPR+RIC-exosome组大鼠血清和心肌组织匀浆中的IL-1β和IL-10水平与CA/CPR组无显著差异。9.RIC-exosome显著减轻H/R诱导的心肌细胞损伤。PKH26标记的exosome与原代心肌细胞共孵育6小时后可观察到exosome摄取。流式细胞术检测心肌细胞凋亡,结果显示RIC-exosome显著减轻H/R诱导的心肌细胞凋亡;Western blot检测凋亡蛋白指标Cleaved caspase 3、Bax和Bcl-2也得到了一致结论。CCK8检测细胞活力,ELISA法检测LDH活性,结果显示,RIC-exosome可显著改善H/R造成的细胞活力下降,减轻细胞损伤。10.GW4869逆转了 RIC诱导的心肌保护作用作为外泌体抑制剂,GW4869的应用显著减少了 RIC诱导的血浆exosome含量,同时逆转了 RIC诱导的心肌保护作用。体外实验同样证实,使用GW4869可逆转RIC-exosome的抗心肌细胞凋亡作用。11.miR-542-5p 在 RIC-exosome 中显著上调miRNA芯片分析和qPCR验证结果提示,miRNA-542-5p含量在大鼠和人来源的RIC-exosome中显著上调。并且成熟miRNA-542-5p以RIC-exosome为载体,从骨骼肌运输至心肌。12.miRNA-542-5p在PCAMD中发挥心肌保护作用大鼠心肌特异性过表达miRNA-542-5p可改善ROSC后大鼠心功能和7d生存率,减少心肌细胞凋亡;与RIC-exosome同时注射miRNA-542-5p antagomir可逆转RIC-exosome的心肌保护作用。13.miRNA-542-5p通过抑制IGF2R表达减少心肌细胞凋亡生信分析结果和mRNA测序结果提示,IGF2R是miRNA-542-5p的下游靶基因。Western blot和荧光素酶报告基因结果证实,miRNA-542-5p可抑制IGF2R表达,从而抑制IGF2R下游凋亡基因表达,发挥抗心肌凋亡作用。细胞实验中过表达IGF2R可逆miRNA-542-5p的抗凋亡作用。研究结论1.ROSC后立即静脉注射RIC-exosome可改善心脏骤停后心功能障碍,减少心肌细胞死亡,提高大鼠ROSC后生存率。2.miRNA-542-5p在RIC-exosome中特异性上调,在PCAMD中发挥心肌保护作用。3.miRNA-542-5p通过抑制IGF2R及其下游基因表达,发挥抗心肌细胞凋亡作用。