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在哺乳动物生精上皮中,血睾屏障（blood-testis barrier,BTB）由相邻睾丸支持细胞间的紧密连接组成,可以将生精上皮分隔成基底室和近腔室,为精子生成提供一个微环境。研究表明微小RNAs（microRNAs,miRNAs）对动物睾丸发育、细胞生长以及精子发生起着关键的调控作用。本课题组前期通过miRNA芯片技术检测到miR-181c和miR-181d（miR-181c/d）在大白猪60日龄与180日龄睾丸组织中差异表达。本文探究miR-181c/d在调控睾丸支持细胞生长和屏障中的功能。主要研究内容与结果如下:1.miR-181c/d在小鼠睾丸支持细胞屏障功能中的作用（1）通过对15-16日龄昆明小鼠的睾丸注射包裹miR-181c/d的慢病毒（LVmiR-181c/d）,成功构建睾丸内超表达miR-181c/d的小鼠模型。在小鼠睾丸完成最后一次慢病毒注射2周后,对小鼠进行称重并检测其睾丸外形,发现:与对照组小鼠相比,LV-miR-181c/d处理组小鼠睾丸大小、睾丸与体重比值均无显著变化。H＆E染色发现LV-miR-181c/d处理组小鼠的睾丸与附睾组织学形态均无显著改变。取小鼠附睾尾精子进行精子计数和吉姆萨精子染色,发现:与对照组小鼠相比,LV-miR-181c/d处理组小鼠睾丸精子数量略有下降,而精子畸形率显著升高（P＜0.01）。小鼠睾丸组织切片的TUNEL/WT1双标染色和Ki67染色发现,相比于对照组小鼠,LV-miR-181c/d处理组小鼠睾丸曲细精管内TUNEL阳性细胞数目增多（P＜0.05）,TUNEL阳性的支持细胞（TUNEL和WT1双阳性细胞）数目增多（P＜0.05）,但Ki67阳性细胞数目无显著差异。以上结果表明:睾丸内过表达miR-181c/d导致小鼠精子畸形率升高、睾丸内支持细胞凋亡的数目增多。（2）通过免疫荧光试验检测BTB相关蛋白（N-cadherin、β-catenin、ZO-1、Occludin）在小鼠睾丸曲细精管中的分布情况,发现:LV-miR-181c/d处理组小鼠睾丸内BTB相关蛋白分布紊乱,不再紧密定位在靠近基底膜处。通过Western blot试验检测发现,在对照组与LV-miR-181c/d处理组小鼠睾丸中,BTB相关蛋白的表达量均无显著变化。使用鬼笔环肽（phalloidin）对小鼠睾丸组织中F-actin进行染色,发现LV-miR-181c/d处理组小鼠睾丸中,F-actin结构紊乱且不再紧密靠近基底膜处。进一步通过透射电镜（transmission electron microscopy,TEM）试验检测发现,与对照组小鼠相比,LV-miR-181c/d处理组小鼠睾丸内BTB超微结构出现断裂、空泡等现象。最后,将生物素biotin注射进入小鼠睾丸间质内,观察小鼠睾丸曲细精管内生物素的渗透情况,结果显示:LV-miR-181c/d处理组小鼠睾丸内生物素可以渗透进入曲细精管的管腔。但在小鼠睾丸完成慢病毒注射6周后,LV-miR-181c/d处理组小鼠睾丸中紊乱分布的BTB相关蛋白恢复正常定位,且精子畸形率降低和BTB完整性得到了恢复。以上结果表明:LV-miR-181c/d处理会导致小鼠睾丸内BTB功能出现短期的损伤,在一段时间后可以得到恢复。（3）体外分离培养的原代小鼠睾丸支持细胞（Sertoli cells,SCs）,建立支持细胞屏障,模拟睾丸内BTB功能。miR-181c/d mimics转染至SCs细胞,不同时间点测定支持细胞跨上皮电阻（trans-epithelial electrical resistance,TER）和荧光素钠（sodium fluorescein,Na-F）渗透率,发现过表达miR-181c/d减弱了支持细胞间TER值（P＜0.05）,增加了支持细胞间Na-F渗透率（P＜0.05）,导致体外支持细胞屏障功能下降。进一步通过免疫荧光染色和Western blot试验发现,过表达miR-181c/d使得BTB相关蛋白不再紧密定位在支持细胞与支持细胞界面,蛋白分布变得紊乱;但没有改变BTB相关蛋白的表达量。随后,通过TEM试验检测发现过表达miR-181c/d损伤了支持细胞与支持细胞间紧密连接的超微结构,即紧密连接结构在一些位置会出现断裂和分布弥散。采用phalloidin对小鼠支持细胞骨架F-actin进行染色,发现过表达miR-181c/d使得F-actin结构变得紊乱、排列不规整、微丝出现交叉。以上结果表明:miR-181c/d通过扰乱细胞骨架F-actin结构,改变了BTB相关蛋白在细胞骨架F-actin上的定位,影响了支持细胞与支持细胞界面细胞连接的稳定性,从而损伤支持细胞屏障功能。（4）双荧光素酶报告系统验证了miR-181c/d可以靶向血小板活化因子乙酰水解酶1β亚基1（platelet-activating factor acetylhydrolase 1b regulatory subunit 1,PAFAH1B1）的3’非翻译区（3’untranslated region,3’UTR）。通过Western blot试验检测发现,miR-181c/d可以抑制内源性PAFAH1B1蛋白的表达。采用TER和Na-F试验检测发现,抑制表达Pafah1b1基因减弱了支持细胞间TER值（P＜0.05）,增加了支持细胞间Na-F的渗透性（P＜0.05）。进一步通过免疫荧光染色和Western blot试验发现,抑制Pafah1b1的表达改变了BTB相关蛋白在支持细胞与支持细胞界面的定位;但BTB相关蛋白的表达量在对照组和干扰Pafah1b1组中均无显著变化。随后,通过TEM试验检测发现,抑制Pafah1b1表达损伤了支持细胞与支持细胞间的紧密连接超微结构。使用phalloidin对支持细胞骨架F-actin进行染色,发现抑制Pafah1b1表达导致F-actin结构排布紊乱,微丝出现交叉现象。以上结果表明:抑制Pafah1b1表达扰乱细胞骨架F-actin结构,改变了BTB相关蛋白在支持细胞骨架Factin上的定位,紊乱支持细胞与支持细胞界面的细胞连接的稳定性,从而改变了支持细胞屏障功能。（5）通过Western blot试验发现,在体外SCs细胞中超表达miR-181c/d或抑制表达Pafah1b1,与在小鼠睾丸内超表达miR-181c/d均能下调肌动蛋白调节蛋白CDC42、PAK1、LIMK1与p-Cofilin的表达。同时,通过挽救试验检测发现,抑制表达miR-181c/d上调肌动蛋白调节蛋白的作用被干扰Pafah1b1或干扰Cdc42基因所阻滞。通过ZDOCK软件预测及Co-IP试验发现PAFAH1B1与IQ结构域GTP酶激活蛋白1（IQ motif-containing GTPase activating protein 1,IQGAP1）之间存在互作。并且在小鼠SCs细胞中过表达miR-181c/d或抑制表达Pafah1b1均能导致PAFAH1B1-IQGAP1复合体减少。2.miR-181c/d在睾丸支持细胞生长中的作用（1）采用CCK-8、Ki67染色、流式细胞术和Western blot试验检测睾丸支持细胞（猪睾丸细胞与小鼠SCs细胞）生长情况。结果显示:与对照组相比,过表达miR-181c/d抑制了支持细胞的增殖（P＜0.05）,促进了支持细胞的凋亡（P＜0.05）;而抑制表达miR-181c/d后,显示出相反的结果,即促进了支持细胞的增殖（P＜0.05）,抑制了支持细胞的凋亡（P＜0.05）。以上结果表明miR-181c/d可以抑制支持细胞的增殖,促进支持细胞的凋亡。（2）通过CCK-8、Ki67染色、流式细胞术和Western blot试验检测细胞生长情况。发现:超表达Pafah1b1可以促进支持细胞的增殖（P＜0.05）,抑制支持细胞的凋亡（P＜0.05）;干扰Pafah1b1基因抑制了支持细胞的增殖（P＜0.05）,促进了支持细胞的凋亡（P＜0.05）。同时,通过挽救试验检测发现,抑制表达miR-181c/d对支持细胞的促增殖/抑凋亡作用被干扰Pafah1b1基因所恢复。以上结果表明:miR-181c/d通过靶基因Pafah1b1介导调控支持细胞的增殖与凋亡。