【摘 要】
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·研究背景晚期前列腺癌患者通常经过抗雄激素治疗后,产生耐药,发展为去势抵抗性前列腺癌（Castration Resistant Prostate Cancer,CRPC）。但是治疗 CRPC 的手段非常有限,死亡率高,因此亟需更有效的疗法。嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor,CAR）免疫细胞治疗是一种新型的有前景的治疗方法。已经有许多文章报道了 CAR NK细胞治疗恶
【基金项目】
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首都科技领军人才项目（No.Z181100006318007）； 国家自然科学基金资助项目（No.81972400，No.32100631）； 北京市优秀人才计划青年骨干项目（No.2018000032600G393）； 北京市癌症希望基金资助项目（No.LC2019B02）；
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·研究背景晚期前列腺癌患者通常经过抗雄激素治疗后,产生耐药,发展为去势抵抗性前列腺癌（Castration Resistant Prostate Cancer,CRPC）。但是治疗 CRPC 的手段非常有限,死亡率高,因此亟需更有效的疗法。嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor,CAR）免疫细胞治疗是一种新型的有前景的治疗方法。已经有许多文章报道了 CAR NK细胞治疗恶性实体肿瘤的可行性。已知前列腺特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen,PSMA）广泛表达在前列腺癌细胞表面。因此,靶向PSMA的CAR NK细胞免疫疗法可能在去势抵抗性前列腺癌的治疗中具有广泛前景。·研究材料和方法本课题构建一种新型的CAR结构,以NK细胞表面激活受体CD244为基础骨架来修饰,分为两部分,第一部分通过对CAR的胞内激活信号区和胞外抗原结合区的筛选,构建出对前列腺癌细胞杀伤性最强的CAR NK92MI细胞。在第一部分中,首先通过细胞杀伤实验和CD107a释放水平来比较CAR的不同的胞内片段CD244、NKG2D和CD3ζ对NK92MI细胞的激活状态,以寻找最佳胞内段结构序列。之后对CAR的胞外抗原结合段进行筛选。通过噬菌体展示技术构建了一种对PSMA抗原具有高亲和力的多肽结构类的胞外段CAR（p-PSMA-CAR）。p-PSMA-CAR与以PSMA抗体为胞外段的CAR（anti-PSMA-CAR）进行比较,以筛选出与PSMA抗原有高结合力的CAR的胞外段。通过对CAR的胞内段和胞外段的筛选,构建出对CRPC细胞具有最强杀伤力和亲和力的CAR NK92MI细胞。本课题的第二部分,通过体外和体内实验来验证构建的CAR NK92MI细胞对CRPC的杀伤性。同时,通过流式细胞术、ELISA检测和免疫荧光技术对CAR NK92MI细胞杀伤CRPC细胞的机制进行了探讨。此外,还探讨了 CAR NK92MI细胞杀伤C4-2细胞是否存在铁死亡的可能性,并探讨相关机制研究。·研究结果对于CAR胞内段的筛选,构建了三种不同CAR的胞内结构区域CARI（CD244）、CAR2（CD244、NKG2D）和 CAR3（CD244、NKG2D 和 CD3ζ）。结果发现CAR2和CAR3对NK92MI细胞激活程度类似,且均高于CAR1。为了缩减CAR结构的大小,故选择CAR2（CD244和NKG2D）作为CAR NK92MI细胞的胞内片段。对于CAR胞外抗原结合区域的筛选,结果发现,与anti-PSMA-CAR NK92MI细胞相比,p-PSMA-CAR NK92MI细胞对PSMA的抗原亲和力更强。因此,选择靶向p-PSMA-CAR作为CAR胞外抗原结构区。之后通过体内外实验证明p-PSMA-CAR NK92MI细胞对CRPC细胞具有强杀伤性,并且p-PSMA-CAR NK92MI细胞可以选择性地杀死PSMA阳性的肿瘤细胞。p-PSMA-CAR NK92MI细胞的杀伤性具有时间和剂量依赖性,在效靶比为15:1时,CRPC细胞裂解率达到77.87%。此外,通过免疫荧光染色发现p-PSMA-CAR NK92MI细胞杀伤CRPC细胞主要通过释放颗粒酶B途径。同时,p-PSMA-CAR NK92MI细胞通过释放过量的IFN-γ可诱导CRPC细胞发生铁死亡。·研究结论本课题构建了一种新型靶向PSMA的多肽类CAR NK92MI细胞（p-PSMA-CAR-NK92MI细胞）,证实了其在体内外均能够有效杀伤CRPC细胞,揭示了其主要通过释放颗粒酶B发挥杀伤作用,并探索了其诱导肿瘤细胞发生铁死亡的机制。
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