论文部分内容阅读
目的在动物水平上研究白藜芦醇改善高脂饮食诱导的小鼠胸主动脉和肝脏组织的焦亡,检测相关分子的表达变化;在细胞水平上探究白藜芦醇通过SIRT1-p66Shc-NLRP3通路改善棕榈酸诱导的人脐静脉内皮细胞焦亡的分子机制。方法1.动物实验部分6周龄清洁级的C57BL/6雄性小鼠适应性喂养2周后随机分为3组,标准饮食组（SCD）、高脂饮食组（HFD）、高脂饮食+白藜芦醇组（HFD+RES）。高脂饮食+白藜芦醇组（HFD+RES）在给予高脂饮食的同时喂饲白藜芦醇400mg/kg/day,持续22周。造模期间监测小鼠体重,造模完成后取小鼠肝脏组织和胸主动脉进行实验。2.组织实验部分小鼠胸主动脉和肝脏组织经脱水和石蜡包埋处理,随后进行苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE染色）,观察小鼠胸主动脉和肝脏组织的形态学变化;免疫组化检测p66Shc、SIRT1、GSDMD、NLRP3;Western blot实验检测小鼠肝脏中SIRT1、p66Shc、NLRP3、Cysteinyl aspartate specific proteinase-1（Caspase-1）、Gasdermin-D（GSDMD）、Interleukin-1 beta（IL-1β）、Interleukin-18（IL-18）蛋白质水平;实时荧光定量PCR分析小鼠肝脏SIRT1、p66Shc、NLRP3、Cysteinyl aspartate specific proteinase-1（Caspase-1）、Gasdermin-D（GSDMD）、Interleukin-1 beta（IL-1β）、Interleukin-18（IL-18）的m RNA表达水平。3.细胞实验部分（1）棕榈酸（palmitic acid;PA）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）焦亡:通过不同浓度梯度的棕榈酸（PA 0 m M、0.2 m M、0.4 m M、0.6 m M、0.8 m M、1.0m M）诱导人脐静脉内皮细胞发生焦亡,通过CCK-8、乳酸脱氢酶（LDH）检测、Western blot、流式细胞术、细胞免疫荧光、细胞透射电镜的方法确定能诱导HUVEC发生焦亡的PA浓度。（2）白藜芦醇改善细胞焦亡:将人脐静脉内皮细胞接种于细胞培养板中（常用六孔板）,分为对照组（CON）、棕榈酸组（PA）和棕榈酸+白藜芦醇治疗组（PA+RES）。Western blot检测各组SIRT1、p66Shc、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18、ASC的蛋白质表达水平;流式细胞术检测各组细胞焦亡水平以及活性氧水平,乳酸脱氢酶（LDH）释放检测细胞焦亡;免疫荧光检测各组NLRP3/ASC共定位、p66Shc表达水平。（3）SIRT1抑制剂EX527:将细胞分为对照组（CON）、棕榈酸组（PA）、棕榈酸+白藜芦醇治疗组（PA+RES）、棕榈酸+白藜芦醇治疗+EX527组（PA+RES+EX527）四个组,Western blot检测各组SIRT1、p66Shc、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18、ASC的蛋白质表达水平;流式细胞术检测各组细胞焦亡水平以及活性氧水平;免疫荧光检测各组细胞NLRP3/ASC共定位、p66Shc表达水平。结果1.动物实验部分:小鼠体重、肝脏和胸主动脉HE染色结果均显示饮食诱导肥胖小鼠的炎症损伤模型构建成功;小鼠肝脏Western blot和q RT-PCR结果显示HFD组SIRT1蛋白和m RNA表达量明显减少,p66Shc、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白和m RNA表达量均显著增加。与HFD小鼠相比,HFD+RES组SIRT1蛋白和m RNA表达量明显增加,p66Shc、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白和m RNA表达量表达均显著降低,且具有统计学意义。肝脏和胸主动脉免疫组化结果也显示了相同的蛋白表达趋势。2.细胞实验部分:（1）浓度为0.2~1.0 m M的棕榈酸能够诱导HUVEC焦亡,且具有剂量依赖性,同时,使SIRT1的蛋白表达量随着PA浓度的升高而减少,p66Shc蛋白表达量随着PA浓度的升高而增多。结合多种实验数据确定后续实验中诱导HUVEC焦亡的PA的浓度为0.4 m M。（2）Western blot、免疫荧光、流式细胞术检测细胞焦亡和活性氧,以及LDH释放水平检测实验显示浓度为50μM的白藜芦醇可以改善PA诱导的HUVEC焦亡,同时,可以降低PA诱导的HUVEC中p66Shc蛋白表达量的增多。（3）Western blot、免疫荧光、流式细胞术等实验结果表明SIRT1抑制剂EX527的加入可抑制白藜芦醇对PA诱导的HUVEC焦亡的改善作用,表明白藜芦醇可能通过上调SIRT1的表达发挥对PA诱导的HUVEC焦亡的改善作用。结论1.白藜芦醇改善高脂饮食所致的小鼠胸主动脉和肝脏组织焦亡,其机制可能与SIRT1、p66Shc、NLRP3通路的分子表达改变有关。2.棕榈酸可诱导HUVEC发生焦亡,增加焦亡相关蛋白的表达,而白藜芦醇对HUVEC的焦亡有改善作用,并且其机制可能与SIRT1-p66Shc-NLRP3通路有关。