油菜是全世界主要农作物之一,是食用植物油和饲用蛋白质的重要来源,其工业用途也十分广泛。杂种优势利用对油菜产量的提高起到了重要推动作用,在杂种优势利用途径中雄性不育的利用是主要途径之一,细胞核雄性不育系9012A及其衍生系已经被广泛应用于油菜杂交种商业化制种,其雄性不育性状由Bn Ms3和Bn Rf两个位点控制。为解析9012A雄性不育及其育性恢复的分子机理,恢复基因Bn Ms3已经被成功克隆,其编码的蛋白与叶绿体内膜转运蛋白Tic40同源;前人对Bn Rf位点已经精细定位,并通过BAC测序得到了临保系中等位基因Bn Rf c的候选区间。本研究在前人研究的基础上,进一步发现不育系和恢复系中Bn Rf候选区间序列与临保系参考序列差异很大。为获得不育系和恢复系中Bn Rf候选区间真实序列,构建了包含Bn Rf位点不育基因BnRf~b和恢复基因Bn Rf a的BAC克隆文库,通过测序分别得到了包含BnRf~b和Bn Rf a的候选区间序列,揭示了不育系和恢复系材料在Bn Rf位点复杂的染色体结构变异。同时,通过分析RG206AB和RG250AB两个不同遗传背景的定位群体,本研究对Bn Rf位点育性控制基因进行了进一步精细定位,并完成了不育基因的克隆与功能验证。主要研究结果如下:1、本研究构建了一个甘蓝型油菜基因组BAC文库,筛选得到了分别包含Bn Rf a和BnRf~b的BAC单克隆。序列分析发现,相对于临保系,不育系和恢复系在Bn Rf位点存在一个大片段插入以及一个局部序列的倒位,Bn Rf基因在恢复系的定位区间实际为58.1 Kb,在不育系中相对应的区间为63.1 Kb。2、根据不育系和恢复系中Bn Rf候选区间的序列差异,新开发了8个分子标记,通过分析RG206AB和RG250AB两个定位群体,最终将Bn Rf a限定到35.9 Kb的物理区间内,预测包含7个开放阅读框(ORF)。3、候选基因G14在不育系和恢复系中的等位基因,在启动子区域存在两个插入缺失变异,最有可能是目标基因。本研究通过农杆菌介导将包含不育系来源G14全长的基因组片段AGS14-1转化到遗传背景为Bnms3的野生型拟南芥中,获得了27株转基因阳性单株。表型调查发现27个阳性单株都表现为花丝短小,花药皱缩,没有可育花粉,其雄性不育表型与RG206A十分相似;T1代阳性单株与野生型杂交,在T2代分离群体中,雄性不育表型与AGS14-1转基因片段共分离。进一步的细胞学观察表明,不育拟南芥与RG206A花药的异常发育过程也基本相同。不仅如此,外源导入Bn Ms3还能够彻底恢复AGS14-1导致的拟南芥雄性不育,这与甘蓝型油菜中Bn Ms3能够特异性恢复9012A类型不育系的育性相一致。因此,可以确认基因组片段AGS14-1包含导致RG206A产生雄性不育的BnRf~b基因。4、将恢复系中与AGS14-1等位的基因组片段AGS14-2导入拟南芥野生型,转基因阳性单株也均表现为雄性不育,因此恢复系来源的基因组片段AGS14-2可能也包含雄性不育基因BnRf~b。因而推测,Bn Rf位点恢复基因Bn Rf a与不育基因BnRf~b可能并不等位,恢复基因可能对应于35.9 Kb候选区段内的另一个基因。5、AGS14-1和AGS14-2片段上都包含预测的开放阅读框G14,其蛋白编码序列完全相同。通过PCR从RG206H花药c DNA文库中扩增获得的G14全长CDS包含9个外显子,编码一个1386个氨基酸的蛋白。DNA水平和蛋白水平的同源性分析表明G14是一个嵌合基因,由3段与不同基因同源的序列组成。由于G14中较大一段序列与mt HSP70-1高度同源,因此我们将G14命名为Bna A7.mt HSP70-1-like。在可育材料RG206H中,Bna A7.mt HSP70-1-like在花药发育的整个过程中持续表达,在减数分裂时期其表达水平较高;而在不育材料RG206A中,Bna A7.mt HSP70-1-like仅在花药发育的减数分裂时期有微弱表达。6、油菜核不育基因Bna A7.mt HSP70-1-like在拟南芥中异位表达,对绒毡层分化相关基因没有明显影响,但却明显抑制了绒毡层退化相关基因的表达。与此相一致,在油菜不育系RG206A中我们观察到绒毡层细胞的PCD明显延迟。7、在公用数据库中的序列比对分析,仅在甘蓝参考基因组上找到一个Bna A7.mt HSP70-1-like基因的同源基因,拟南芥及其他物种中均没有该嵌合基因的同源基因。甘蓝型油菜和白菜参考基因组上也不存在Bna A7.mt HSP70-1-like或其同源基因,但本研究对190份甘蓝型油菜及24份白菜材料进行分析,其中有52份甘蓝型油菜及20份白菜材料包含Bna A7.mt HSP70-1-like基因。