蛋白质的可逆磷酸化修饰是细胞执行各项生物学功能的关键蛋白质翻译后修饰,基因转录过程便受到磷酸化修饰的精密调控。正性转录因子b（p-TEFb）在调控基因转录延伸过程中受到很多正性因子（如Brd4,AFF1等）和负性因子（如HEXIM1,MePCE等）的协同调控,同时利用CDK9亚基的激酶活性对RNA Pol Ⅱ的CTD区域的高度磷酸化及负性转录因子DSIF和NELF的磷酸化修饰作用来调控转录过程。CDK9激酶磷酸化底物蛋白的发现一直是研究的热点,如RNAPol Ⅱ、DSIF和NELF等蛋白的发现和功能研究,但由于磷酸化修饰研究手段的技术限制,进展缓慢。然而,CDK9磷酸化底物蛋白的系统研究对理解p-TEFb基因转录调控过程中发挥的关键作用具有重要的意义。近年来基于生物质谱的蛋白质组学及样品富集技术的发展,为蛋白-蛋白相互作用和磷酸化蛋白质研究提供十分强大的支撑。因此,本论文基于定量磷酸化蛋白质组学技术对CDK9磷酸化底物蛋白进行了系统分析,并对其中的关键底物蛋白进行了生物学验证和机制研究。本论文建立CDK9表达稳定敲低的细胞模型,通过磷酸化蛋白富集和定量质谱分析,成功鉴定磷酸化蛋白1046个,其中,磷酸化水平降低的蛋白109个;同时从全蛋白质水平,定量了 8000多个蛋白,发现CDK9敲低对600多个基因转录有一定影响,其中7个蛋白的磷酸化水平也有所降低;通过BioID技术进一步验证CDK9的底物蛋白,最后得到68个可能底物蛋白库。从质谱检测结果中发现敲低CDK9表达水平或抑制CDK9的激酶活性都会导致MePCE蛋白的磷酸化水平有70%左右的降低,并用18O-ATP标记的定量酶促反应蛋白质组学分析确认MePCE可以被CDK9直接磷酸化,鉴定了 S（60、69、216、217、254及330）和T192等7个高可信度磷酸化位点。同时,基于色谱质谱连用技术（HPLC-MS/MS）对成功表达的野生型和突变型MePCE的甲基化酶活性进行考察,对7sk snRNA的酶解产物进行分析,发现磷酸化对MePCE的甲基转移酶活性有一定的影响,特别是S60位点,在突变成丙氨酸后,MePCE-S60A不再具有甲基转移酶活性。利用qRT-PCR检测MePCE对细胞内7sk snRNA的稳定性时也有同样的结果。进一步的研究结果表明MePCE的磷酸化会导致7sk snRNP结合减弱。将MePCE蛋白中S60和S216-217位点突变成丙氨酸后,MePCE与7sksnRNP结合增强,CDK9不能顺利从7sksnRNP中解离。在报告基因实验结果显示,S60A和S216-217A突变的MePCE对HIV-1基因转录有更强的抑制作用,说明在转录激活过程中CDK9磷酸化MePCE促使P-TEFb从7sk snRNP中解离。综上,本论文系统鉴定了 CDK9潜在的底物蛋白,发现CDK9可以通过其磷酸化修饰调控蛋白7sk snRNP复合物的解离,从而影响基因转录延伸过程,丰富了 CDK9对基因转录延伸调控机制的理解。