【摘 要】
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核酸包括DNA和RNA都是体内重要的生物大分子,其中DNA以双螺旋结构存在于染色质中,而RNA主要以单链形式存在于细胞中并与各种蛋白或核酸相互结合发挥作用。除特定的生物学功能以外,许多特殊序列的DNA和RNA与特定的金属离子或小分子结合后会具有催化活性,例如催化核酸断裂或者作为过氧化物酶存在。其中具有催化活性的RNA称为核酶(Ribozyme),具有催化活性的DNA称为脱氧核酶(DNAzyme),
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核酸包括DNA和RNA都是体内重要的生物大分子,其中DNA以双螺旋结构存在于染色质中,而RNA主要以单链形式存在于细胞中并与各种蛋白或核酸相互结合发挥作用。除特定的生物学功能以外,许多特殊序列的DNA和RNA与特定的金属离子或小分子结合后会具有催化活性,例如催化核酸断裂或者作为过氧化物酶存在。其中具有催化活性的RNA称为核酶(Ribozyme),具有催化活性的DNA称为脱氧核酶(DNAzyme),它们被统称为核酶(Nucleozyme)。能催化核酸断裂的核酶一般都是特殊的RNA或者DNA序列与金属离子形成的三级结构,具有过氧化物酶活性的核酶主要有DNA G四链体或者RNA G四链体分别与氯化血红素(hemin)形成的复合物。核酸除了有特殊的结构外还有各种修饰,例如RNA中含量最多的假尿嘧啶修饰(Ψ)。这些结构和修饰所具备的的特殊的特征使核酸的功能更为丰富多彩,让我们意识到核酸不仅可以作为生命的遗传物质还可以调控很多生命活动,甚至变成一种工具而被人们运用到其它的地方。本文聚焦于核酶在生物检测中的应用,不仅利用RNA G四链体和氯化血红素(hemin)形成的特殊Ribozyme来检测和分离RNA G四链体,还开展了利用10-23 DNAzyme来对RN A中Ψ修饰的检测。(1)利用Ribozyme进行RNA G四链体的检测分离G四链体是由富含鸟嘌呤的核酸在一定条件下折叠形成的一种高级结构。相比于DNA G四链体功能的广泛认知,人们对RNA G四链体具体功能的认知还比较少。在体内RNA G四链体的折叠状态还有些争议,而开发新的检测及分离RNA G四链体的方法对解决这些争议是非常必要的。此论文介绍了一种新的RNA G四链体的检测及分离方法。我们利用RNA G四链体和hemin的复合物具有的过氧化物酶活性将RNA G四链体生物素化,然后利用斑点杂交试验对生物素信号进行显色和利用链霉亲和素磁珠对生物素化的RNA G四链体进行分离,并结合高通量技术开展了RNA G4的全转录组分析。该方法对于能形成G四链体结构的经典的或者非经典的RNA G四链体都能有很好的检测作用。而且由于hemin在细胞内是本来就存在的,为检测体内的内源的RNA G四链体提供了可能性。(2)DNAzyme和滚环扩增反应的结合检测假尿嘧啶修饰假尿嘧啶修饰(Ψ)是转录后修饰最为丰富的且唯一的质量沉默的化学修饰。随着测序技术的不断发展,Ψ已不再局限于非编码RNA中,人们在m RNA中也发现非常多的Ψ的位点存在。而且Ψ的修饰是动态变化的,这些Ψ的修饰被认为是行使了很多重要的生物功能的。虽然人们认为m RNA中也存在非常多的Ψ的位点,但是其中被经典方法验证的并不太多,可能原因是这些Ψ的修饰水平比较低,那么就需要开发更为灵敏的方法来对Ψ进行检测。本论文结合10-23DNAzyme对RNA中U和Ψ的切割能力差异性和滚环扩增反应将差异性放大对Ψ进行了检测。通过利用滚环扩增反应就不需要对检测样本进行放射性标记或者CMCT标记,就能将U和Ψ的区别转化为更为安全易得的荧光信号的差异,提高了检测方法的灵敏性,为检测低丰度样本提供了可能性。
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