目的:布鲁氏菌(布病)是世界范围内的传染病,其致病机理(包括胞内寄生机理)以及免疫机理尚不十分清楚是布鲁氏菌病防控过程中的一个瓶颈。脂多糖(LPS)是布鲁氏菌的主要毒力因子,同时又是重要的免疫分子,LPS合成基因组成高度保守,但不同株型的OPS的O侧链结构存在差异。已经发现的与布鲁氏菌LPS合成相关的关键基因有wbk A、gmd、wzm、wzt、wbk B、wbk C等,其中wzt基因是ABC转运系统的主要组成部分,是LPS合成的关键基因。GENBANK中注释的wzt基因的功能为水解ATP释放出能量,参与OPS侧链转移到外膜上的过程,进而形成光滑型LPS,研究发现,该基因的缺失会造成LPS的合成受阻,但其性质及如何参与LPS合成的机制尚未见报道。研究Wzt蛋白在LPS合成和运输中如何行使ATP酶活性,探讨Wzt蛋白作为免疫候选抗原的可行性及在分子诊断中的作用,可为进一步研究其在LPS合成中的作用及作为控制布鲁氏菌的靶位可能性提供实验依据。方法:本研究对布鲁氏菌wzt基因密码子进行优化,构建其原核表达载体、应用亲和层析的方法纯化Wzt蛋白,对纯化的蛋白进行基于Edman降解法的N端序列分析。根据ATP能够催化荧光反应的原理对纯化后的Wzt蛋白的ATP酶活进行测定,应用生物信息学软件Jpred3和Phyre2预测蛋白质模型以及酶活性中心的关键氨基酸,并选取预测的位点进行突变并检测其ATP酶活,与未突变蛋白的酶活进行比较。将纯化后蛋白与弗氏佐剂混合后免疫家兔,免疫四周后收集兔血清并进行纯化,制备Wzt蛋白抗体,对其进行抗体特异性检测并用其检测wzt基因缺失菌株;将纯化后蛋白与弗氏佐剂混合免疫BALB/c小鼠,MTT法检测免疫后第四周小鼠脾淋巴细胞增殖情况;间接ELISA方法检测第1至8周小鼠血清抗体Ig G效价。结果:成功构建了原核表达载体p ET21b-wzt;在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了28k Da的蛋白,N端测序结果显示表达蛋白为目的蛋白,目的蛋白的纯度为93%,蛋白回收率为2%;该蛋白具有ATP酶活性,0.05mg Wzt蛋白10min催化产生32872.12nmol ATP;LYS72和ASN68为其酶活性中心的关键氨基酸,这两个位点突变后酶活分别降低为62%和67%;Wzt蛋白对小鼠淋巴细胞增殖百分数影响比Con A高40%;Wzt蛋白可以刺激机体产生Ig G抗体抗体效价在第四周达到最高,最高值为1:4200,但抗体从第五周开始消失较快该抗原制备的多克隆抗体特异性良好,可用于检测wzt基因。