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目的：①将TRIM28克隆到可诱导表达载体,建立稳定表达TRIM28的细胞系。②探讨TRIM28调控蛋白表达水平及其对靶基因的稳定性作用,揭示其生物学新功能。③检测TWIST的泛素化,探讨TRIM28是否具有调节TWIST的泛素化作用及其调节机制。方法：首先,将TRIM28克隆到可诱导表达载体；以已有TRIM28的cDNA作为模板,高保真PCR多聚酶扩增,用EcoRV和NheI双酶切将pcDNA5/ FRT/TO表达载体消化后与相同内切酶消化的TRIM28连接,获得pc DNA5/FRT/TO/TRIM28重组质粒。其次,建立稳定的表达TRIM28细胞系并分析其表达和可能的功能；将pcDNA5/FRT/TO/TRIM28重组质粒转染入宿主细胞Flp-InTMT-RExTM-293细胞系,潮霉素B筛选获得阳性克隆。再次,将获得的pcDNA5/FRT/TO/TRIM28转染入内源性表达TWIST的4T1细胞中,通过Real-Time PCR和WB分析TRIM28对TWIST的可能调节作用。本课题完成了如下实验：1、经酶切、PCR和测序验证了阳性克隆；2、采用不同剂量的DOX以及不同作用时间对pcDNA5/FRT/TO-TRIM28 HEK293 (293-TRIM28)细胞系进行诱导表达,用Western blotting检测TRIM28的表达情况；3、将重组质粒pcDNA5/FRT/TO/TRIM28转染入4T1细胞,并通过免疫印迹分析其在细胞内的表达情况。4、在内源性表达TWIST的4T1细胞中转入TRIM28和空载体,通过WB检测其刘TWIST的调节作用。5、MDA-MB-435细胞加入蛋白质泛素化抑制剂MG-132,不同时间处理,免疫印迹分析TWIST的稳定性。6、DOX诱导pcDNA5/ FRT/TO-TRIM28 HEK293 (293-TRIM28)细胞系,同时过表达TWIST和UB,用WB检测TWIST的泛素化。结果：构建了pcDNA5/F RT/TO/TRIM28重组质粒及可被DOX诱导的稳定表达pcDNA5/TRIM28的细胞系。将空载体和重组质粒转入细胞,发现无论加DOX还是不加DOX诱导转染了空载体pcDNA5/FRT/TO的对照组HEK293细胞系中,都检测不到TRIM28的表达。而转染了pcDNA5/FRT/TO-TRIM28的HEK293细胞系中在加入DOX诱导后,发现TRIM28有较高的表达,而在没有加DOX诱导的细胞系中未检测到表达。同时我们发现在诱导表达时0.001μg/ml的DOX即可诱导pcDNA5/TRIM28细胞系的表达,0.01μg/ml的DOX可使pcDNA5/TRIM28细胞系的表达明显增强,DOX的浓度增加为0.1μg/ml时,TRIM28的表达最为显著。DOX对该细胞系的作用1h后即可出现但较弱,2h后该细胞系的TRIM28表达明显增强。通过逆转录反应和荧光定量PCR我们发现TWIST的mRNA在转染了TRIM28的4T1细胞中的表达量低于转染了空载体的表达量,但是差异没有意义(P>0.05)。但是我们发现TWIST蛋白的表达在转染了TRIM28的4T1细胞中也低于转染了空载体的表达量,且差异有统计学意义(P<0.05)。MDA-MB-435细胞加入蛋白质泛素化抑制剂MG-132,不同时间处理,免疫印迹分析TWIST的表达增高,说明TWIST存在泛素化调节而提高其稳定性。DOX诱导pcDNA5/FRT/TO-TRIM28 HEK293 (293-TRIM28)细胞系,同时过表达TWIST和UB,用WB检测,结果显示TRIM28促进了TWIST泛素化。结论：本研究建立了可诱导稳定表达TRIM28的细胞系,研究结果表明TRIM28不显著减少TWIST mRNA的表达,但它显著减少TWIST蛋白的表达。TWIST存在泛素化调节。这说明TRIM28对TWIST的调控可能主要在翻译水平而非转录水平,但是具体的调控机制还有待于进一步的研究。