论文部分内容阅读
研究背景及目的终末期肾脏疾病的最佳治疗手段是肾脏移植,移植技术和手术方法的不断发展提高了肾移植的成功率,冷保存技术的改进也保证了移植肾存活率显著提高。但静态冷保存过程中,供体肾脏不可避免的会经历血流中断和长期的冷缺血。前期建立的小鼠肾脏冷保存动物模型发现,肾小球内皮细胞的损伤是其中最早出现的显著病理变化,这一损伤会导致肾脏的滤过功能受损并与移植肾的急、慢性失功和功能恢复有关,且会影响到再灌注过程。肾脏冷保存损伤的分子机制与依赖血流的机械敏感性转录因子KLF2(Krüppel-like factor 2)表达降低相关。KLF2的表达受正常血流切向力的调节,诱导内皮细胞产生一氧化氮合酶(e NOS),促进血管合成NO,抵抗炎症,保护内皮细胞不受损伤。在冷保存过程中由于血流突然中断,KLF2的表达降低,内皮细胞出现炎症,最终导致内皮功能障碍。除动态的切向力外,KLF2的表达还可被他丁类药物上调,基于离体肾脏形态学观察及相关损伤指标的检测结果,已证明肾小球内皮细胞是冷保存过程中的最初损伤部位,并且内皮损伤导致的微循环障碍是冷缺血损伤和其他肾脏缺血性疾病的共同特征,因此本研究通过建立人肾小球内皮细胞系静态冷保存模型,使用辛伐他丁(Simvastatin)上调KLF2的表达,研究肾小球内皮细胞的冷保存损伤机制,通过研究阐明KLF2在此过程中的分子机制,不仅能够为肾脏冷保存提供新的改良策略和思路,也有利于发现新的缺血性疾病的预防和治疗手段。方法培养人肾小球内皮细胞(HRGEC),将其按不同需求分组。分组一:(1)正常对照组(Control,Ctrl);(2)冷保存6小时溶剂组(CS6h-Veh);(3)冷保存6小时辛伐他丁组(CS6h-Sim)。分组二:(1)正常对照组(Control,Ctrl);(2)IL-1β刺激不冷保存组(白介素-1β);(3)加白介素-1β刺激后冷保存6小时溶剂组(IL-1β+CS6h-Veh);(4)加白介素-1β刺激后冷保存6小时辛伐他丁组(IL-1β+CS6h-Sim)。具体检测指标:(1)检测在冷保存或加药后哪个时间点KLF2的表达变化显著,从而确定冷保存时间点;(2)观察冷保存后细胞的贴壁形态;(3)观察细胞超微结构;(4)在蛋白及基因水平检测相关因子:KLF2、NF-κB、Caspase-3、Cyt-C、Beclin-1、p62、e NOS。结果(1)在人肾小球内皮细胞冷保存模型中,在6h时KLF2表达显著降低,且在加入药物辛伐他丁6h时KLF2表达显著上调。(2)人肾小球内皮细胞冷保存6h后在倒置显微镜下观察贴壁细胞形态改变:与Ctrl组相比,CS6h-Veh组细胞肿胀变圆,胞质向外伸出的突起变得不完整,有大量黑色斑点出现;与CS6h-Veh组相比,CS6h-Sim组肿胀变圆的细胞减少。细胞超微结构变化:与Ctrl组相比,CS6h-Veh组细胞核染色质不均、胞质内出现大量自噬小体;与CS6h-Veh组相比,CS6h-Sim组胞质内仍然存在大量自噬小体。(3)人肾小球内皮细胞冷保存6h后KLF2、NF-KB蛋白表达:与Ctrl组相比,CS6h-Veh组KLF2蛋白表达降低,NF-κB表达升高;与CS6h-Veh组相比,CS6h-Sim组KLF2蛋白表达升高,NF-κB蛋白表达降低。(4)人肾小球内皮细胞冷保存6h后KLF2及其主要下游e NOS的m RNA表达:与Ctrl组相比,CS6h-Veh组KLF2 m RNA表达降低,e NOS m RNA表达降低;与CS6h-Veh组相比,CS6h-Sim组KLF2 m RNA表达升高,e NOS m RNA表达升高。(5)人肾小球内皮细胞冷保存6h后凋亡相关蛋白表达:与Ctrl组相比,CS6h-Veh组Caspase-3、Cyt-C蛋白表达升高;与CS6h-Veh组相比,CS6h-Sim组Caspase-3、Cyt-C蛋白表达减少。(6)人肾小球内皮细胞冷保存6h后自噬相关蛋白表达:与Ctrl组相比,CS6h-Veh组Beclin-1表达增加,p62表达减少;与CS6h-Veh组相比,CS6h-Sim组Beclin-1持续增加,p62持续减少。(7)白介素刺激细胞后冷保存,KLF2及炎症因子NF-KB蛋白表达:与Ctrl组相比,加入白介素刺激组KLF2的表达降低,NF-κB表达升高,但并不具有统计学意义。与加白介素不冷保存组(IL-β)相比,IL-1β+CS6h-Veh组KLF2表达降低,NF-κB表达升高;与IL-1β+CS6h-Veh组相比,IL-1β+CS6h-Sim组KLF2表达升高,NF-κB表达降低。结论在人肾小球内皮细胞冷保存损伤模型中,KLF2可以通过增加自噬、抑制炎症关键因子NF-κB、上调内皮保护性因子e NOS等3种途径发挥内皮细胞保护作用。