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肺炎克雷伯菌是不可忽视的医院和社区获得性感染的重要病原菌,可引起肺炎、尿路感染、腹腔感染、血流感染等[9],1986年,我国台湾地区率先报道了可引起社区获得性肝脓肿的高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae,hvKp）[1,2]。相较于主要引发呼吸道及尿路感染的普通肺炎克雷伯菌（classic Klebsiella pneumoniae,c KP）,hvKp多表现为高粘液表型,致病力显著增强,主要在健康人群中引起社区获得性肝脓肿等严重感染,且肝脓肿患者极易引发远处转移和播散感染,如眼内炎和脑膜炎等[3,4],hvKp引起的血流感染30天死亡率高达30%以上[5,6]。hvKp目前在世界范围内呈广泛播散的状态,特别是在亚洲地区,其中以台湾和韩国最为流行[6-8]。近年来,我国hvKp感染病例报道逐年增加,社区获得性肝脓肿致病菌中hvKp占比高达58.3%～90.9%,目前已严重威胁人类健康[9]。hvKp高毒力的形成及致病机制目前仍不完全清楚,导致相关感染的防控面临严峻挑战。流行病学研究发现,约90%的hvKp均携带一个约200kb的毒力基因编码质粒,该质粒除编码黏液表型调控因子Rmp A/A2以参与荚膜多糖（CPS）合成外,还同时编码铁载体Aerobactin（iuc ABCD基因簇编码）和Salmochelin（iro BCDN基因簇编码）等hvKp特异性毒力因子。消除该毒力质粒后,hvKp致病性显著下降,表明该质粒对hvKp高毒力的形成发挥着至关重要的作用。课题组前期通过比较基因组分析,以血流感染、呼吸道及尿路感染分离的c Kp作对照,在临床肝脓肿来源hvKp的毒力质粒中检出一种特异存在的pagO基因。该基因最早于1998年在鼠伤寒沙门氏菌染色体中检出,编码一个包含300个氨基酸残基的膜转运体蛋白。以NCBI＿Genome收录的肺炎克雷伯菌基因组数据进行大样本验证发现,hvKp中该基因的检出率（95.6%）远高于血流感染（25.0%）、呼吸道及尿路感染（10%）分离的c Kp,表明质粒携带的pagO基因与引起肝脓肿的hvKp存在显著的流行病学相关性,提示PagO蛋白可能是与hvKp致病性相关的毒力因子。本课题聚焦于质粒编码的PagO蛋白,探讨其在hvKp致病性中的作用,同时对PagO介导hvKp致病性的分子机制进行深入研究,研究内容主要包括以下3个部分:第一部分高毒力肺炎克雷伯菌的临床和分子特征分析目的明确pagO基因在不同类型及不同克隆株中的分布特点,分析该基因与菌株致病性的关联,梳理pagO基因的流行病学特征。方法收集2014年1月至2016年12月上海交通大学附属仁济医院就诊的社区获得性肝脓肿病例,初步定义以肝穿刺脓液培养分离的肺炎克雷伯菌为hvKp,同时随机选取同时期院内获得性血流感染患者分离的肺炎克雷伯菌作对照,该组排除肝脓肿等侵袭性感染。采用拉丝实验确定菌株的高黏液表型,PCR筛查相关毒力基因及荚膜血清型,同时结合血清抵抗实验及小鼠致死实验评估菌株毒力,并采用微量肉汤稀释法测定临床菌株对常用抗菌药物的敏感性。结果共分离47株肝脓肿相关的hvKp,血流感染对照组菌株46株。hvKp引发的肝脓肿以右肝为主,共36例（76.6%）,且22例（47%）患者有糖尿病病史。hvKp中拉丝试验共有15株阳性（31.9%）,显著高于对照组（5,10.9%）（P=0.014）。血清学分型以K1和K2型为主,共29例（61.7%）,同源性分析以ST23型最为常见,共17株（36.2%）;而对照组K1和K2型仅7例（15.2%）,以ST11型最为常见（23.9%）。血清杀伤试验抵抗型（Grades 5-6）占比在hvKp中（46.8%）也显著高于对照组（P<0.05）。小鼠致死实验证实,肝脓肿来源菌株的LD50要明显低于血流感染来源菌株（P<0.05）。基因筛查发现,hvKp中pagO及其他目前已明确的毒力基因如mag A、rmp A、rmp A2、aerobactin、iut A、all S、kfu等的检出率与对照组均存在显著性差异（P<0.05）。结论社区获得性肝脓肿来源的肺炎克雷伯菌为高毒力肺炎克雷伯菌,毒力显著高于血流感染相关的普通肺炎克雷伯菌,且质粒携带的pagO基因与肝脓肿来源的hvKp存在显著的流行病学相关性。第二部分质粒编码PagO蛋白在hvKp致病性中的作用分析目的具体明确质粒编码的PagO蛋白在高毒力肺炎克雷伯菌致病性中的作用。方法随机选取肝脓肿来源的ST23型hvKp,采用同源重组的方法构建的pagO缺失突变株,并用表达质粒p Bad33构建重组质粒,电转敲除株以构建相应的pagO基因回补株。采用血清抵抗实验、中性粒细胞吞噬试验等体外实验并结合小鼠肝脓肿模型,比较基因敲除前后hvKp抵抗宿主免疫防御能力、吞噬细胞内的滞留及促进小鼠肝脓肿形成能力的改变,明确PagO蛋白在hvKp致病性中的作用。结果中性粒细胞吞噬试验发现,相较于hvKp临床株,pagO基因敲除株在不同时间点存活率均出现显著下降,并更易被中性粒细胞吞噬;敲除株回补pagO基因后,回补株抗吞噬能力显著强于敲除株;而pagO基因敲除前后对血清杀伤的抵抗作用并无显著性改变。动物试验发现,相较于pagO基因敲除株,hvKp临床株可导致小鼠肝脏出现多发脓肿病灶,且炎性渗出及气球样变等病理损伤均更为明显。研究同时发现,hvKp敲除pagO基因后,对小鼠的致死率及肝、脾、盲肠等主要脏器菌落计数均出现显著下降。结论质粒编码的PagO蛋白可显著增强hvKp抗吞噬能力,促进hvKp高毒力的形成。第三部分质粒编码PagO蛋白促进hvKp致病性的分子机制目的探讨质粒编码的PagO蛋白促进hvKp高毒力形成的分子机制。方法构建体外H2O2应激模型,比较hvKp野生株、pagO基因敲除株及回补株在H2O2作用下菌株生长状况。同时pagO突变菌株与敲除株及野生株均以硫化物作为半胱氨酸合成的基础原料,定量监测不同菌株不同时间点培养基上清中的半胱氨酸含量。构建编码胱氨酸吸收转运体的fliy基因的敲除株和回补株,分别阻断胱氨酸吸收转运和半胱氨酸的分泌途径,以H2O2应激模型分析不同菌株生长状况,明确PagO蛋白参与的半胱氨酸-胱氨酸循环在hvKp抗氧化应激损伤中的作用。同时采用正常小鼠巨噬细胞NADPH氧化酶抑制试验,通过阻断巨噬细胞内活性氧的产生,比较上述不同菌株在巨噬细胞中菌体内活性氧的动态变化及菌株存活情况。结果H2O2应激模型中,pagO敲除株对H2O2应激能力明显下降,差异有统计学意义;半胱氨酸分泌实验证实,pagO敲除株在各个时间点分泌半胱氨酸的量也出现显著降低;分别阻断胱氨酸吸收转运和半胱氨酸的分泌途径后,菌株在H2O2应激模型中的生长能力显著下降;小鼠巨噬细胞NADPH氧化酶抑制试验发现,加入NADPH氧化酶抑制剂后,pagO、fliy敲除株和hvKp临床株在巨噬细胞中不同时间点的存活能力并无显著性差异。结论PagO蛋白以半胱氨酸转运体的形式参与跨膜的半胱氨酸-胱氨酸循环,通过增强细菌对抗外源性氧化应激损伤的能力,抵抗固有免疫细胞的吞噬和清除,促进hvKp高毒力的形成。