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本研究以新疆地产葡萄海棠果为原料,通过酵母菌与乳酸菌两种益生菌复合发酵的方式,制备出一款葡萄海棠果酵素,对葡萄海棠果酵素的理化成分进行分析,设计该款酵素的体外试验结合动物试验,采用分子生物学的方法对葡萄海棠果酵素的改善高脂血症、降低血脂水平的作用及其机制进行研究,具体研究成果如下:
(1)将海棠果与葡萄(红提)作为原料,设计单因素试验结合正交试验得出最佳工艺条件。最终结果表明益生菌复合发酵的最佳工艺条件为:酵母菌首先接种发酵24h,发酵温度设置为25℃、接种量0.20%、初始pH3.80、质量比5∶1,后向葡萄海棠果发酵液中再次接种0.50%乳酸菌,在37℃条件下,静置发酵28h,得到的葡萄海棠果酵素酵母菌浓度为7.70×108CFU/mL、乳酸菌浓度为5.20×108CFU/mL、SOD酶活力为485.25U/mL。
(2)采用改良的比色法测定葡萄海棠果酵素中总酚、总黄酮含量;y15全自动葡萄酒检测仪检测花青素含量;参照GB4789-2010检测酵素的微生物指标;原子荧光法测定酵素的重金属指标。葡萄海棠果酵素成分分析数据显示,葡萄海棠果酵素含有丰富的总酚、总黄酮含量,分别为286.60mg没食子酸当量/g提取物,198.40mg儿茶素当量/g提取物;花青素含量为549mg/L;各项微生物指标及重金属指标均符合卫生安全要求。
(3)通过不同浓度的葡萄海棠果酵素与甘胺胆酸盐和牛磺胆酸盐的结合能力,评价葡萄海棠果酵素体外降血脂效果,通过DPPH、ABTS和羟基自由基的清除率来表征葡萄海棠果酵素的抗氧化活性。结果表明葡萄海棠果酵素对DPPH、ABTS和羟基自由基清除率分别为84.68%、66.68%、71.51%;当葡萄海棠果酵素的浓度达到1mL/mL时,葡萄海棠果酵素与甘氨胆酸盐、牛磺胆酸盐的结合率分别达到64.75%、72.68%,证实葡萄海棠果酵素具有较好的体外降血脂活性。
(4)高脂乳剂灌胃法构建大鼠高脂血症模型,灌喂0.25mL/mL、0.50mL/mL、1.00mL/mL的葡萄海棠果酵素,同时以血脂康作为阳性对照;采用罗氏c701,免疫透射比浊法监测ApoA1、ApoB;酶法监测TC、TG、LDL-C、HDL-C、SOD、CAT、MDA;制作SD大鼠肝脏病理切片通过HE染色并在显微镜下观察高脂血症大鼠肝脏病变程度,利用免疫组化的方法检测SD大鼠肝脏FAS、PPAR-α、PPAR-γ蛋白水平的变化。动物试验中,葡萄海棠果酵素显著降低了SD大鼠TC、TG、LDL-c、MDA和载脂蛋白ApoA1,显著升高高密度脂蛋白(HDL-C)和载脂蛋白ApoB以及SOD、CAT含量,很好的改善了血清脂质过氧化,减少了动脉硬化的风险;肝脏病理学检查发现与高脂血症模型组相比,葡萄海棠果酵素组处理的SD大鼠肝脏病理切片脂肪变性明显改善,葡萄海棠果酵素具有很好的保护肝脏的功能;葡萄海棠果酵素中、低剂量组,PPAR-α、PPAR-γ等蛋白表达水平较模型组明显升高,葡萄海棠果酵素能够通过激活PPAR-α、PPAR-γ为代表的脂质代谢信号通路,改善高脂血症疾病。
(1)将海棠果与葡萄(红提)作为原料,设计单因素试验结合正交试验得出最佳工艺条件。最终结果表明益生菌复合发酵的最佳工艺条件为:酵母菌首先接种发酵24h,发酵温度设置为25℃、接种量0.20%、初始pH3.80、质量比5∶1,后向葡萄海棠果发酵液中再次接种0.50%乳酸菌,在37℃条件下,静置发酵28h,得到的葡萄海棠果酵素酵母菌浓度为7.70×108CFU/mL、乳酸菌浓度为5.20×108CFU/mL、SOD酶活力为485.25U/mL。
(2)采用改良的比色法测定葡萄海棠果酵素中总酚、总黄酮含量;y15全自动葡萄酒检测仪检测花青素含量;参照GB4789-2010检测酵素的微生物指标;原子荧光法测定酵素的重金属指标。葡萄海棠果酵素成分分析数据显示,葡萄海棠果酵素含有丰富的总酚、总黄酮含量,分别为286.60mg没食子酸当量/g提取物,198.40mg儿茶素当量/g提取物;花青素含量为549mg/L;各项微生物指标及重金属指标均符合卫生安全要求。
(3)通过不同浓度的葡萄海棠果酵素与甘胺胆酸盐和牛磺胆酸盐的结合能力,评价葡萄海棠果酵素体外降血脂效果,通过DPPH、ABTS和羟基自由基的清除率来表征葡萄海棠果酵素的抗氧化活性。结果表明葡萄海棠果酵素对DPPH、ABTS和羟基自由基清除率分别为84.68%、66.68%、71.51%;当葡萄海棠果酵素的浓度达到1mL/mL时,葡萄海棠果酵素与甘氨胆酸盐、牛磺胆酸盐的结合率分别达到64.75%、72.68%,证实葡萄海棠果酵素具有较好的体外降血脂活性。
(4)高脂乳剂灌胃法构建大鼠高脂血症模型,灌喂0.25mL/mL、0.50mL/mL、1.00mL/mL的葡萄海棠果酵素,同时以血脂康作为阳性对照;采用罗氏c701,免疫透射比浊法监测ApoA1、ApoB;酶法监测TC、TG、LDL-C、HDL-C、SOD、CAT、MDA;制作SD大鼠肝脏病理切片通过HE染色并在显微镜下观察高脂血症大鼠肝脏病变程度,利用免疫组化的方法检测SD大鼠肝脏FAS、PPAR-α、PPAR-γ蛋白水平的变化。动物试验中,葡萄海棠果酵素显著降低了SD大鼠TC、TG、LDL-c、MDA和载脂蛋白ApoA1,显著升高高密度脂蛋白(HDL-C)和载脂蛋白ApoB以及SOD、CAT含量,很好的改善了血清脂质过氧化,减少了动脉硬化的风险;肝脏病理学检查发现与高脂血症模型组相比,葡萄海棠果酵素组处理的SD大鼠肝脏病理切片脂肪变性明显改善,葡萄海棠果酵素具有很好的保护肝脏的功能;葡萄海棠果酵素中、低剂量组,PPAR-α、PPAR-γ等蛋白表达水平较模型组明显升高,葡萄海棠果酵素能够通过激活PPAR-α、PPAR-γ为代表的脂质代谢信号通路,改善高脂血症疾病。