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奶酪是一种以新鲜奶液为原料,添加凝乳酶(MCE,Milk-clotting Enzyme)与发酵剂制作的发酵乳制品,除了含有丰富的蛋白质、脂质、钙、磷和维生素营养成分外,奶酪还含有丰富的酪啡肽、磷酸肽、免疫活性肽等生物活性多肽。传统上凝乳酶是通过提取年幼反刍动物,主要是小牛的皱胃来生产的。过去几十年中,基因工程菌越来越多地被开发应用于商业凝乳酶的生产,如今只有20-30%凝乳酶来自小牛皱胃酶。利用基因重组技术,将微生物凝乳酶基因在特定宿主细胞中进行重组表达,可以有效改善培养条件复杂、分离提取困难、酶专一性不强等问题。本研究从高产凝乳酶解淀粉芽孢杆菌出发,克隆鉴定了凝乳酶基因,并通过大肠杆菌与枯草芽孢杆菌两种表达系统对凝乳酶基因进行了表达验证,获得了凝乳酶基因序列;在此基础上,优化了重组菌株的诱导条件,并对重组酶进行了纯化及性质研究。首先,通过比对MALDI-TOF-MS技术鉴定的凝乳酶肽段,查找同源序列,以解淀粉芽孢杆菌基因组DNA为模板,先后尝试克隆了凝乳酶基因序列MCEamy与pro MCE,分别构建表达载体,通过大肠杆菌重组表达验证,仅重组质粒p ET-28a-pro MCE成功表达具有凝乳酶活力的重组酶。重组蛋白表达鉴定及基因测序结果分析表明,pro MCE是凝乳酶基因的前体肽与成熟肽编码基因,且前体肽序列在重组凝乳酶活性表达中起着必要作用。随后对重组菌株在摇瓶中的诱导因素进行了优化,在以4%转接量,37℃,200r·min-1培养5 h后,添加IPTG至终浓度为0.2 mmol·L-1,转至22℃,150 r·min-1诱导培养18 h后,破碎上清液凝乳酶活达到最高,最高凝乳酶活力为117.24±2.28 SU·m L-1。以质谱肽段比对的同源序列出发,设计引物,尝试从B.amyloliquefaciens JNU002中克隆凝乳酶含信号肽基因序列c MCE,插入p MA5,构建了穿梭表达载体p MA5-c MCE。将其在枯草杆菌WB600中进行表达验证,活性重组酶分泌到胞外,c MCE成功获得表达,重组酶活力为4.67 SU·m L-1;研究结果鉴定了包含信号肽、前体肽及成熟肽的完整凝乳酶基因序列c MCE。通过镍柱亲和层析对重组大肠杆菌凝乳酶进行了纯化,纯化前后凝乳酶回收率为66.51%,重组酶分子量大小为27.5 k Da。在此基础上,对纯化后凝乳酶进行了酶学性质研究。结果表明该酶在70℃拥有最高凝乳酶活力,在65℃表现最大蛋白酶活力。在60℃处理25 min,凝乳酶活力与蛋白酶活力均被钝化超过80%,表明该酶为热不稳定性酶。酶的凝乳酶活力在p H为5时达到最高,在p H为7时,凝乳酶活力迅速下降为0,蛋白酶活力在p H为9时达到最高。重组酶的凝乳酶活力在p H 5-7区间内相对稳定,能保留70%的凝乳活力;蛋白酶活力在p H>5范围内,都较为稳定,残留蛋白酶活力超过80%。酶作用的最适Ca2+浓度为0.04 mol·L-1。金属离子对酶的凝乳活力与蛋白酶活力影响不大。