3-甲基丁醛是切达奶酪产生坚果风味的关键香气化合物。乳酸乳球菌作为发酵剂应用于切达奶酪的生产,可以有效提高奶酪中3-甲基丁醛的含量。然而,在乳酸乳球菌中,3-甲基丁醛通过哪些基因所编码的蛋白合成,其合成途径又是受哪些因素所调控等尚未证实。基于此,本课题从测定乳酸乳球菌生产3-甲基丁醛的产量差异出发,通过关键酶活性测定、全基因组测序、氨基酸序列比对、定量PCR实验、大肠杆菌中蛋白的异源表达等多种分子生物学手段进行了研究分析,主要研究结论如下:（1）首先测定了14株乳酸乳球菌的产3-甲基丁醛能力,其中菌株408产量最高,为140.2μM/L,其次为菌株IMJ 10-7,其产量为47.9μM/L。通过选取三株产量高中低差异较大的菌株进行全基因组测序,对其相关基因多样性进行初步探究。在所有三个菌株中都发现了存在直接途径相关的bca T基因、gdh基因和kdc A基因的存在,以及与间接途径相关的pta基因、ack基因和adh E基因。在三株产量不同的乳酸乳球菌中共发现了三种编码α-酮酸脱羧酶（α-keto dehydrogenase,KADC）的kdc A基因,长度分别为1647bp、1374bp和1311bp,两种短节kdc A基因在末端缺少部分功能性片段。在三株菌株中均没有发现编码α-酮酸脱氢酶（α-keto dehydrogenase,KADH）的bkd基因簇,通过同源性比对搜索,相似度最高的是编码丙酮酸脱羧酶的pdh基因簇。（2）为了验证乳酸乳球菌3-甲基丁醛潜在的合成途径,分别通过酶活性测定、间接途径酶抑制实验和定量PCR实验进行探究。通过对直接途径KADC酶和间接途径KADH酶活性的检测,仅在乳酸乳球菌408和乳酸乳球菌IMJ 10-7中发现KADC酶活性,同时在所有的乳酸乳球菌菌株中都检测到KADH酶活性,其中乳酸乳球菌408的KADC活性和KADH酶活性均最高。Na As O2抑制实验表明,在缺乏ptb-buk-bkd DABC基因簇的情况下,所有的乳酸乳球菌菌株中都能够通过间接途径产生3-甲基丁醛。q PCR结果表明,在存在亮氨酸的情况下,乳酸乳球菌408和乳酸乳球菌IMJ 10-7的pdh D、ack和pta基因均高度表达,表明PDH、ACK和PTA三个蛋白均参与到乳酸乳球菌3-甲基丁醛间接合成途径。综合上述结果,提出了乳酸乳球菌中3-甲基丁醛的生物合成全路径,其中只有直接途径KADC酶完整和间接途径基因表达水平高的乳酸乳球菌菌株（如菌株408）才能具有高产3-甲基丁醛的潜力。（3）为了验证三种不同KADC蛋白的结构差异和动力学参数,将编码三种kdc A基因（kdc A-long、kdc A-middle和kdc A-short）在大肠杆菌中进行异源表达,并对相应的重组蛋白进行了表征。对获得的三种KADC蛋白进行酶活性测定,仅在KADC-long中检测到KADC活性。通过同源性建模预测了三种KADC重组蛋白的结构,我们发现在KADC-middle和KADC-short无活性是因为缺失了催化亮氨酸底物所必须的一个保守性活性位点残基（Glu462）和S-口袋结构。KADC-long的酶活性在p H 7和30℃时最高。底物水解和动力学参数表明,KADC-long可以高效地合成2-甲基丁醛和3-甲基丁醛。此外,将kdc A-long基因在低产3-甲基丁醛乳酸菌菌株中异源表达,能够使低产的菌株的产量显著增加,表明kdc A-long基因在乳酸乳球菌生物合成3-甲基丁醛的过程中具有重要作用。