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第一部分经颅磁刺激对帕金森病的治疗作用及相关机制研究研究背景:帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种因多巴胺能神经元缺乏而引起的神经退行性疾病。PD的确切发病机制仍不清楚,年龄老化、氧化应激、遗传及环境因素等均可能导致PD发生发展。近年来,细胞衰老在PD发病中的作用越来越受到重视。细胞衰老是增殖细胞离开细胞周期并进入永久性生长停滞,其显著特征是分泌大量的生物活性物质,即细胞衰老相关分泌表型（SASP）因子。在帕金森病患者中,该类因子常表达异常。经颅磁刺激（TMS）近年来广泛用于神经系统疾病的诊断和治疗,它应用脉冲磁场穿过颅脑,产生一定强度的感应电流,作用于人体脑组织,从而调节不同脑区的神经元的兴奋性,影响局部脑血流及脑内神经递质代谢。本研究入组了108例帕金森病患者,随机分为r TMS组和假r TMS组,同时匹配了54名对照组,对比帕金森病患者r TMS治疗前后运动诱发电位的改变、运动症状及非运动症状的改善及细胞衰老相关因子（IL1β、IL 6、TNF及MMP-3等）表达的变化,从而探索r TMS是否通过抗细胞衰老相关因子表达来治疗帕金森病临床症状的相关机制。目的:（1）帕金森病患者SASP因子的水平及其与PD病情程度的相关性分析;（2）高频r TMS治疗对PD患者的治疗作用;（3）高频rTMS治疗对PD患者血清SASP因子表达的影响。方法:（1）临床评定:对入组的108名PD患者进行Hoehn＆Yahr分级,运动诱发电位检测,运动症状（UPDRS评分、计时运动试验、折返运动试验）、非运动症状评分（非运动症状筛查问卷、汉密尔顿抑郁焦虑量表、认知功能评定、睡眠状况评定、自主神经功能障碍程度评定）;采用随机数字表法随机分为r TMS组（54名）和假r TMS组（54名）。分别给予5Hz高频r TMS及假r TMS治疗2个疗程共4周。（2）实验室研究:外周血SASP因子（TNF、IL1β、IL 6、MMP-3）的检测。结果:（1）治疗前,两组患者运动症状及非运动症状评分比较均没有明显差异,无统计学意义（P＞0.05）;（2）与治疗前相比,r TMS组治疗后及治疗后1个月,患者UPDRS I、UPDRSⅡ、UPDRSⅢ评分及总分均明显降低,患者右手和左手1min平均运动次数明显增加（P＜0.01）,10米折返运动平均用时明显减少（P＜0.01）,差异有统计学意义（P＜0.05）;HAMA、HAMD评分比治疗前有显著降低（均P＜0.01）,而MMSE量表评分较治疗前的显著增高（P＜0.01）;P300潜伏期PL较治疗前缩短,波幅Amp较治疗前增高均（P＜0.01）。NMSQuest频率及程度评分均明显下降,差异与统计学意义（P＜0.05）,但PDSS评分虽均稍有降低,但差异无统计学意义（P＞0.05）。上述指标与假r TMS组治疗后及治疗后1个月组间相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）。假r TMS组,治疗1个疗程结束后及治疗后1个月患者运动症状及非运动症状评分较治疗前未有明显改变,差异无统计学意义（P＞0.05）。（3）治疗前,rTMS组和假rTMS组血清TNF、IL-6、IL-1β及MMP-3比较差异无统计学意义（P＞0.05）,但均明显高于正常对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗后,r TMS组血清TNF、IL-6、IL-1β及MMP-3较治疗前均有所下降,但差异无统计学意义（P＞0.05）,但r TMS治疗后1个月,患者血清TNF、IL-6、IL-1β及MMP-3较治疗前均明显下降,差异有统计学意义（P＜0.05）。r TMS治疗后1个月与假r TMS组治疗后1个月组间相比,上述指标差异均有统计学意义（P＜0.05）。假r TMS组,治疗后及治疗后1个月血清TNF、IL-6、IL-1β及MMP-3均较治疗前未有明显改变,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论:（1）帕金森病患者细胞衰老因子均明显异常,并与患者病情程度呈明显相关;（2）5Hz高频r TMS可以改善帕金森病患者的运动症状及非运动症状;（3）5Hz高频r TMS治疗可以改善帕金森病患者血清细胞衰老因子水平的变化。第二部分FBXO22泛素化降解PHLPP1并激活AKT通路调控帕金森病的相关机制研究研究背景:鱼藤酮（Rotenone）是从豆科植物中提取的一种剧毒脂溶性广谱杀虫剂,是类鱼藤素中最有效的成员之一。鱼藤酮可以特异性的穿过血脑屏障,在亚细胞细胞器中蓄积,据报道,鱼藤酮可诱导黑质多巴胺能变性、神经炎症、氧化应激,特别是细胞内泛素和突触核蛋白的积累,可成功制作PD大、小鼠模型。FBXO22是一种人们知之甚少的蛋白质,它可能与神经系统疾病有关。然而,FBXO22在PD中的相关研究尚未见报道。Akt（又称蛋白激酶B,PKB）是PI3K/Akt/m TOR信号通路中重要的信号传导分子,该信号通路能调节细胞生长及转运,具有促细胞存活作用。在PD治疗中,多项研究表明,激活PI3K/Akt/m TOR通路,具有保护作用,而抑制该通路则作用相反。PHLPP1（PH域富亮氨酸重复蛋白磷酸酶1）是一种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶,属于2c型磷酸酶（PP2C）家族,能与AKT形成某种复合物,并使其去磷酸化。在神经元中,下调PHLPP也可使AKT途径的激活增加,故而能减少MPP+（1-甲基-4-苯基吡啶）所致的细胞毒性,保护了细胞。我们通过利用鱼藤酮来诱导SH-SY5Y细胞和作用于大鼠,来模拟PD的基本病理变化和行为变化,而后对其进行干预,并通过评价干预后相关分子生物学标志物的变化,来探讨FBXO22对AKT通路的调节机制,进而进一步探讨其对PD改善作用的机制,为PD的新的治疗策略提供实验依据。目的:研究FBXO22在鱼藤酮导致的帕金森病中的调控作用。方法:（1）建立PD细胞模型:应用人神经胶质瘤细胞SH-SY5Y,给予鱼藤酮处理,逆转录病毒转染技术在细胞内过表达或敲减FBXO22或PHLPP1,采用MTT法检测细胞活力。western blot检测基因蛋白表达。流式细胞术检测细胞凋亡情况。通过IF测定活性氧的产生。采用LDH-细胞毒性检测试剂盒检测LDH活性。通过Co-IP检测FBXO22与PHLPP1的结合能力。（2）建立PD动物模型:SD雄性大鼠,皮下注射鱼藤酮,1.5 mg/kg/d,连续4周。将包装的高滴度慢病毒颗粒LV-FBXO22或LV-GFP进行浓缩,最终调整浓度为1×1010 TU/ml用于注射,进行大鼠中FBXO22的过表达。实验分组:（I）con,（II）ROT,（III）ROT+LV-GFP,（IV）ROT+LV-FBXO22。每组10只。给予运动能力测试。IHC检测TH（tyrosine hydroxylase）阳性细胞。Western Blot检测FBXO22、PHLPP1、p AKT/AKT,pm TOR/m TOR,cleaved caspase 3表达。结果:（1）鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞后,细胞活力降低,细胞凋亡增强,FBXO22蛋白表达下调。左旋多巴对PD细胞模型中FBXO22的表达无影响。（2）过表达FBXO22减少了鱼藤酮处理介导的细胞凋亡,使得细胞活力增强,LDH活性降低,ROS水平降低;p AKT/AKT、pm TOR/m TOR和Bcl-2水平增强,Bax和cleaved caspase 3水平降低。（3）FBXO22泛素化降解PHLPP1:上调FBXO22后,PHLPP1 m RNA表达未发生变化,PHLPP1蛋白表达下降,证明FBXO22影响PHLPP1蛋白的表达,而不影响PHLPP1m RNA的表达,提示该调控可能通过泛素化实现;Co-IP检测结果表明FBXO22与PHLPP1结合;上调FBXO22后,PHLPP1的泛素化作用增强。（4）PHLPP1通过下调pAKT/AKT和pm TOR/m TOR水平从而抑制AKT活性:鱼藤酮处理后PHLPP1蛋白表达增强,p AKT/AKT和pm TOR/m TOR水平降低;PHLPP1过表达抵消了下调PHLPP1诱导的pAKT/AKT和pm TOR/m TOR水平的升高。（5）PHLPP1过表达部分逆转了FBXO22过表达所引起的鱼藤酮所致的神经毒性降低:在鱼藤酮处理的基础上,过表达PHLPP1挽救了过表达FBXO22诱导的p AKT/AKT和pm TOR/m TOR水平的升高,降低FBXO22过表达引起的Bcl-2水平升高以及Bax和cleaved caspase 3水平下降。。（6）FBXO22过表达可以减轻鱼藤酮诱导的PD大鼠症状;鱼藤酮诱导的PD大鼠模型FBXO22表达下调,PHLPP1表达上调,p AKT/AKT和pm TOR/m TOR水平降低,凋亡相关蛋白cleaved caspase 3水平升高,TH表达降低;FBXO22过表达增强鱼藤酮诱导的PD大鼠FBXO22蛋白表达,抑制PHLPP1蛋白表达,p AKT/AKT和pm TOR/m TOR水平升高,cleaved caspase 3水平降低,并增强了TH蛋白的表达。结论:FBXO22泛素化降解PHLPP1可通过激活AKT通路改善鱼藤酮所致的神经毒性,提示FBXO22可能是一种有效的PD治疗生物标志物。