论文部分内容阅读
第一部分miR-425-5p对脐静脉内皮细胞单羧酸转运体4表达及细胞生物学行为的影响目的:糖尿病（diabetes mellitus,DM）血管并发症是2型糖尿病患者致死、致残的最主要原因,其早期的病理表现是高血糖引起内皮细胞（endothelial cells,ECs）功能障碍和细胞凋亡,导致血管内皮损伤。ECs以糖酵解供能为主,产生的乳酸主要依赖单羧酸转运体4（monocarboxylate transporter 4,MCT4）转运至胞外,且MCT4的下调可参与DM内皮功能障碍的发生。然而,MCT4的调控机制仍不明确。微小RNA（MicroRNA,miRNA）是调控MCT家族的重要方式之一,本部分旨在探究DM状态下MCT4的miRNA调控机制。方法:首先,利用PicTar,TargetScan和miRcode等生物学软件预测,发现miR-425-5p与MCT4编码基因的3’-UTR具有潜在的结合位点。采用q-PCR检测2型DM患者及健康志愿者血液标本中miR-425-5p表达情况,发现DM患者中miR-425-5p表达上调。然后,提取人原代脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）进行培养及鉴定。检测高糖（high glucose,HG）（30 mM）和白介素 1β（Interleukin 1β,IL-1β）（10 ng/mL）联合干预的HUVECs中miR-425-5p表达情况。采用双荧光素酶法验证miR-425-5p与MCT4编码基因3’-UTR 的结合。使用 miR-425-5p 模拟物（miR-425-5p mimics）（80 nM）、miR-425-5p 抑制物（miR-425-5p inhibitor）（80 nM）及其阴性对照（80 nM）干预 HUVECs,干预 48h 后,采用 q-PCR、Western blot、免疫荧光、乳酸检测试剂盒、pH检测试剂盒、流式细胞术、CCK-8、细胞划痕实验等检测miR-425-5p对HUVECs的MCT4表达,胞内乳酸积聚,pH变化和HUVECs凋亡、增殖及迁移的影响。为进一步探究miR-425-5p inhibitor对HG+IL-1β诱导的HUVECs凋亡的影响,分别使用miR-425-5p inhibitor（80 nM）及其阴性对照（80 nM）转染 HUVECs,转染 24h 后,使用 HG（30 mM）+IL-1β（10 ng/mL）干预 HUVECs;干预 48h 后,采用 Western blot 检测 HUVECs 的 MCT4蛋白及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3的表达情况,同时采用流式细胞术检测HUVECs凋亡情况。结果:（1）与对照组相比,HG+IL-1β干预的HUVECs中miR-425-5p表达显著上调（P＜0.05）;与健康志愿者相比,2型DM患者血浆和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中的 miR-425-5p 表达也显著上调（P＜0.05）。（2）双荧光素酶报告实验结果显示:MCT4编码基因是miR-425-5p的靶基因,MCT4编码基因3’-UTR中173-181核苷酸的位置是miR-425-5p结合位点。（3）与对照组相比,miR-425-5p mimics组MCT4表达水平显著下调,而miR-425-5p inhibitor组MCT4表达水平显著上调（P＜0.05）。（4）与对照组相比,miR-425-5p mimics组HUVECs胞内乳酸水平显著升高,而miR-425-5p inhibitor组HUVECs胞内乳酸水平显著降低（P＜0.05）;与对照组相比,miR-425-5p mimics组HUVECs胞内pH值明显降低,而miR-425-5p inhibitor组HUVECs胞内pH值有所升高,但无统计学差异（P＞0.05）。（5）与对照组相比,miR-425-5p mimics组HUVECs的Bcl-2表达显著下调,Bax和Cleaved Caspase-3 表达显著上调,而 miR-425-5p inhibitor 组 HUVECs 的 Bcl-2表达显著上调,Bax和Cleaved Caspase-3表达显著下调（P＜0.05）;类似的,流式细胞术检测结果也显示:与对照组相比,miR-425-5p mimics组HUVECs凋亡率显著升高,而miR-425-5p inhibitor组HUVECs凋亡率显著降低（P＜0.05）。（6）与对照组相比,miR-425-5p mimics组HUVECs的迁移率明显下降、增殖率显著降低,而miR-425-5p inhibitor组HUVECs的迁移率显著升高、增殖率显著增加（P＜0.05）。（7）与对照组相比,miR-425-5p inhibitor 组 HUVECs 的MCT4、Bcl-2表达显著上调,Bax和Cleaved Caspase-3表达显著下调（P＜0.05）;类似的,流式细胞术检测结果也显示:与对照组相比,miR-425-5p inhibitor组HUVECs凋亡率显著降低（P＜0.05）。结论:DM环境促进HUVECs的miR-425-5p表达。MCT4编码基因是miR-425-5p的靶基因,miR-425-5p抑制HUVECs的MCT4表达。DM环境通过上调miR-425-5p,靶向抑制HUVECs的MCT4表达,引起胞内乳酸积聚、细胞酸化,导致HUVECs凋亡增加。miR-425-5p抑制HUVECs的迁移和增殖。miR-425-5p inhibitor通过上调MCT4蛋白的表达,减轻HG+IL-1β诱导的HUVECs凋亡。第二部分 NF-κB/miR-425-5p/单羧酸转运体4信号轴对脐静脉内皮细胞凋亡的影响及其机制目的:细胞核转录因子Kappa B（Nuclear factor kappa B,NF-κB）信号在DM状态下被激活,并在DM内皮损伤中发挥关键作用。NF-κB信号的激活不仅可以调控细胞因子和趋化因子等的释放,也可以调控miRNA的表达。既往研究显示,miR-425-5p启动子区有3个NF-κB的结合位点。本课题第一部分研究结果显示:DM条件下,miR-425-5p表达上调,抑制ECs的MCT4表达,引起胞内乳酸跨膜转运障碍,导致胞内乳酸积聚、细胞酸化,引起内皮凋亡增加,促进内皮损伤。但DM条件下,NF-κB信号的激活是否与ECs中miR-425-5p的上调及下游细胞生物学行为直接相关仍是未知。本部分旨在探究DM状态下,NF-κB信号的激活对HUVECs中miR-425-5p、MCT4表达及HUVECs凋亡的影响。方法:采用原代培养的HUVECs作为研究对象,首先将NF-κB基因序列构建到pcDNA3.1载体中,并将miR-425-5p启动子区域构建到pGL3-Basic vector载体中。分别使用构建成功的pcDNA3.1-NF-κB或pcDNA3.1转染HUVECs,同时分别转染pGL3-miR-425-5p或pGL3-Basic,转染24h后,使用双荧光素酶报告试剂盒测定荧光素酶的活性。然后,分别使用HG（30 mM）+IL-1β（10 ng/mL）和/或NF-κB信号抑制剂SN50（50 μg/mL）干预HUVECs,干预48h后,采用Western blot 和 q-PCR 检测 HUVECs 核内 NF-κB p65 和 p-NF-κB p65 蛋白以及HUVECs胞内miR-425-5p、MCT4蛋白及mRNA的表达情况,同时采用乳酸检测试剂盒、细胞内pH检测试剂盒测定HUVECs胞内乳酸水平和pH值。分别使用 HG（30 mM）+IL-1β（10 ng/mL）和/或 NF-κB 信号抑制剂 SN50（50 μg/mL）干预HUVECs 48h后,采用Western blot检测HUVECs的凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3的表达情况,同时采用流式细胞术检测HUVECs凋亡情况。结果:（1）与对照组相比,HG+IL-1β组NF-κB p65蛋白的磷酸化水平显著增加、miR-425-5p表达显著上调,而NF-κB信号抑制剂SN50可以显著抑制HG+IL-1β诱导的NF-κB p65蛋白的磷酸化和miR-425-5p的上调（P＜0.05）。（2）双荧光素酶报告实验结果显示:与pcDNA3.1+pGL3-miR-425-5p组相比,pcDNA3.1-NF-κB+pGL3-miR-425-5p 组荧光素酶活性明显升高（P＜0.05）。（3）与对照组相比,HG+IL-1β组HUVECs的MCT4表达水平显著下调,而NF-κB信号抑制剂SN50可以显著逆转HG+IL-1β诱导的HUVECs MCT4下调（P＜0.05）。（4）与对照组相比,HG+IL-1β组HUVECs胞内乳酸水平显著升高、pH值显著降低,而NF-κB信号抑制剂SN50可以显著抑制HG+IL-1β诱导的乳酸水平升高和pH值降低（P＜0.05）。（5）与对照组相比,HG+IL-1β组HUVECs的Bcl-2表达明显下调,Bax和Cleaved Caspase-3表达明显上调,而NF-κB信号抑制剂SN50可以显著逆转HG+IL-1β诱导的Bcl-2下调以及Bax和Cleaved Caspase-3的上调（P＜0.05）。类似的,流式细胞术检测结果也显示:与对照组相比,HG+IL-1β组HUVECs凋亡率明显升高,而NF-κB信号抑制剂SN50可以显著逆转HG+IL-1β诱导的HUVECs凋亡率上升（P＜0.05）。结论:HG+IL-1β干预可激活NF-κB信号,并通过与miR-425-5p启动子区域结合,促进HUVECs的miR-425-5p表达。NF-κB信号激活可明显抑制HUVECs的MCT4表达,促进HUVECs胞内乳酸水平升高和pH值下降。NF-κB信号激活可明显促进HUVECs的凋亡。DM条件下,NF-κB/miR-425-5p/MCT4信号轴的激活在ECs凋亡和DM内皮损伤中发挥重要作用。第三部分整体水平探讨miR-425-5p在糖尿病内皮损伤中的作用目的:本课题前两部分研究结果显示:DM环境可通过上调miR-425-5p,靶向抑制HUVECs中MCT4的表达,引起胞内乳酸积聚、细胞酸化,导致HUVECs凋亡增加;且NF-κB/miR-425-5p/MCT4信号轴在DM条件下被激活,并在ECs凋亡和DM内皮损伤中发挥重要作用,而NF-κB信号抑制剂SN50可以通过下调miR-425-5p的表达,抑制HG+IL-1β诱导的HUVECs凋亡。以上体外实验结果均表明,miR-425-5p可能在DM血管内皮损伤的过程中发挥重要作用。本部分拟在动物水平进一步验证miR-425-5p在DM血管内皮损伤中的作用。方法:雄性C57BL/6小鼠（4-5周龄）经1周适应性喂养后,随机分为糖尿病组（DM）和正常对照组（NC）,DM组小鼠给予高糖高脂饮食,NC组小鼠给予普通饲料。高糖高脂饮食4周后,开始禁食12h,DM组小鼠腹腔注射STZ（30mg/Kg,使用0.1mol/L无菌柠檬酸缓冲液配制）,持续4天,NC组小鼠腹腔注射相应体积的无菌柠檬酸缓冲液（0.1mol/L）。DM组小鼠连续三次测得的空腹血糖大于16.7mmol/L则认为DM模型造模成功。选取造模成功的DM组小鼠（N=12）和NC组小鼠（N=12）继续饲养10周后,每组小鼠均分为两组,并分别尾静脉注射 AAV9-miR-425-5p inhibition（100μL,滴度为 4.78E+12 v.g./ml）或等剂量阴性对照AAV9-NC,即最终分为4组:DM+AAV9-NC组（N=6）、DM+AAV9-miR-425-5p inhibition组（N=6）、NC+AAV9-NC 组（N=6）和 NC+AAV9-miR-425-5p inhibition 组（N=6）。继续饲养 6 周后,检测各组小鼠血糖情况及主动脉miR-425-5p表达情况。并分别采用Western blot、q-PCR、免疫荧光法和主动脉根部油红染色法检测各组小鼠主动脉MCT4蛋白、mRNA和主动脉内皮CD31的表达情况。结果:（1）与NC组相比,DM组血糖水平明显升高（＞16.7mmol/L）;与NC+AAV9-NC组相比,DM+AAV9-NC组小鼠主动脉miR-425-5p表达明显上调;与 DM+AAV9-NC 组相比,DM+AAV9-miR-425-5p inhibition 组小鼠血糖未发生明显变化,但主动脉miR-425-5p表达明显下调（P＜0.05）。（2）与NC+AAV9-NC组相比,DM+AAV9-NC组小鼠主动脉MCT4表达水平明显下调;与 DM+AAV9-NC 组相比,DM+AAV9-miR-425-5p inhibition 组小鼠主动脉MCT4表达水平明显上调（P＜0.05）。（3）与NC+AAV9-NC组相比,DM+AAV9-NC组小鼠主动脉内皮CD31水平下调且出现内皮不连续现象;与DM+AAV9-NC 组相比,DM+AAV9-miR-425-5p inhibition 组小鼠主动脉 CD31水平上调且内皮连续性良好。结论:DM环境促进小鼠主动脉miR-425-5p的表达。miR-425-5p促进小鼠主动脉MCT4的表达下调,抑制miR-425-5p的表达可改善DM引起的主动脉MCT4下调。miR-425-5p促进小鼠主动脉内皮损伤,抑制miR-425-5p的表达可减缓DM引起的主动脉内皮损伤。DM环境通过上调miR-425-5p,促进主动脉MCT4表达下调,引起主动脉内皮损伤。