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人类免疫缺陷病毒(HIV)是引起艾滋病的病原体,分为两型:HIV-1和HIV-2,主要为HIV-1。它和一般的病毒有明显的差别,首先是其基因组相对复杂,编码更多的蛋白质来调控病毒潜伏、激活、转录与复制等过程,其次是它在宿主个体内变异迅速。鉴于HIV-1包膜糖蛋白gp120是HIV-1的主要抗原成分,是检测HIV抗体诊断试剂盒的重要组成成分,也是制备抗gp120单克隆抗体必需的免疫原,应用广泛,意义十分重大。本研究利用分子生物学手段,将gp120的部分编码基因(命名为gp120s)重组到大肠杆菌的表达载体中,并成功地进行了蛋白表达。外膜糖蛋白gp120s的编码基因的克隆和在大肠杆菌中的表达。用聚合酶链式反应PCR从HIV-1型国际标准株pHXB2-gp160的基因序列中扩增出糖蛋白片段基因537bp,插入质粒pET32a中构成重组表达质粒pET32a-gp120s,将其转化大肠杆菌BL21后获得了高效表达,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析其表达产物证实蛋白得到表达且主要存在于包涵体中,凝胶扫描成像分析证实其表达量占菌体总蛋白的45.35%。在诱导4个小时蛋白表达量最大,以包涵体的形式表达。包涵体经过洗涤、溶解、复性和过镍柱后,其纯度达到85%,表明已获得高纯度的目的蛋白。用纯化的重组gp120蛋白作为包被抗原,间接ELISA对5份已知HIV阳性血清中的gp120抗体进行检测,结果表明该纯化蛋白具有一定的抗原活性,能特异性地与HIV抗体反应。本研究在大肠杆菌中成功表达了gp120s蛋白,为进一步发展HIV诊断试剂,研究AIDS亚单位疫苗奠定了一定的基础,为研究HIV主要抗原蛋白的性质提供可能,也为制备HIV-1的诊断抗原和基因工程重组疫苗打下基础。人细胞色素2A6作为细胞色素P450家族中重要的一员在许多药物的代谢过程中发挥着重要的作用。本研究利用体外重组技术,克隆及表达CYP2A6野生株,建立了一个研究CYP2A6酶的平台。通过对野生型进行酶动力学分析和药物抑制高通量筛选,测定酶动力学常数和药物抑制常数,所得数据可为以后研究其多态性等位基因在药物代谢中的作用和在新药开发早期进行新药评价提供重要的信息。通过定点突变法得到CYP2A6野生型的cDNA(1.5Kb),并将之克隆到酵母表达载体pYES2/CT上,通过测序得以证实;重组质粒转入已经整合了细胞色素P450氧化还原酶基因(POR)的酿酒酵母中,半乳糖诱导表达目的蛋白,利用SDS-PAGE和Western Blot分析表达产物,结果表明菌株得到表达,所得蛋白约为55Kd,与预期大小相同。大量诱导高表达菌株并制备微粒体蛋白,将所制备的微粒体用CO还原示差光谱法进行P450含量测定,在450nm处有吸收峰,含量为23.8 pmol/mg。用适量微粒体蛋白与2A6特异性荧光底物Coumarin进行酶学反应,所得数据用非线性回归分析法计算出Km值、Vmax值和内在清除率CLint值(Vmax/Km),结果表明:酶活很好,得到相应值均与相关报导相近。将底物浓度固定,与系列浓度的抑制剂共同孵育,用荧光检测技术测定已知抑制剂对重组CYP2A6野生型酶的抑制常数,结果表明:CYP2A6特异性抑制剂反苯环丙胺对重组CYP2A6野生型酶有特异性抑制,IC50约为0.05μM,与相关报道数据接近。本文同时用高效液相色谱法初步检测CYP4502A6的酶动力学,摸索条件,所得数据同荧光分析法计算其Km值、Vmax值和内在清除率CLint值(Vmax/Km),与荧光分析法比较,具有非常好的一致性,在说明这个酶稳定性好的同时,也说明这两种方法的科学一致性,使实验结果更加可信。本研究成功构建了CYP2A6野生型基因的酿酒酵母表达体系,所诱导制备的酵母微粒体蛋白活性良好而稳定,所建立的CYP2A6体外生化检测系统和药物高通量抑制筛选系统高效、灵敏、简便,从而为下一步研究与CYP2A6有关的药物-药物相互作用奠定基础,同时也有助于临床上的降低不良反应和提高药效。