西瓜(Citrulluslanatus)是我国重要的经济作物和水果,富含各种营养成分。瓜氨酸作为西瓜的营养成分之一,是一种有效的氧自由基清除剂,在西瓜抗逆性代谢中发挥重要作用。而在人体中,瓜氨酸是参与尿素循环的中间代谢产物,有调节人体机能的作用。鸟氨酸氨甲酰转移酶(OCT)不仅是瓜氨酸合成代谢的关键酶,通过催化鸟氨酸和氨甲醜磷酸反应合成瓜氨酸和磷酸盐,而且参与了高等植物嘧啶与多胺的形成。对西瓜OCT的分离纯化有助于对该酶在西瓜瓜氨酸合成代谢及抗逆调控中作用的研究,从而为改良西瓜品种及选育新品种提供参考依据;而对西瓜OCT基因的克隆、表达及纯化,为研究OCT基因的功能及催化反应机理等研究奠定基础。本研究对西瓜OCT的提取条件进行了优化,利用热处理、盐析及透析法对西瓜OCT进行分离纯化,并对OCT的一些酶学特性进行了研究。同时利用分子生物学方法克隆并分析了西瓜OCT基因,构建了重组OCT蛋白原核表达载体,对其进行了表达、纯化、复性及活性分析。结果如下:1、西瓜OCT提取的最佳条件:Tris-HCl缓冲液pH值为8.5、料液比为1:5及提取时间为4 h;利用热处理、盐析及透析纯化所得该酶的纯化倍数达1.69,回收率达8.53%;该酶的最适温度为30℃,最适pH值为8.0,在此条件下氨甲酰磷酸和鸟氨酸的 Km 值分别为 3.73、8.34mmol/L,Vmax 值分别为 0.32、0.22μmol/(mL-min)。金属离子Ca2+、Mg2+和Mn2+对OCT均有激活作用,而Fe3+、Cu2+、磷酸、精氨酸以及EDTA均抑制该酶的活性。2、西瓜OCT基因的开放阅读框由1137个碱基组成,编码378个氨基酸,分子量约为41.8kD,等电点为8.61;含有两个结合域,分别为CP结构域和鸟氨酸结构域。OCT蛋白二级结构中含有32.8%的α-螺旋,32.8%的无规则卷曲,25.4%的延伸链及8.99%的β-折叠。OCT蛋白的N端主要为亲水性氨基酸,而C端主要为疏水性氨基酸。该蛋白不是跨膜蛋白,无信号肽存在。西瓜OCT蛋白与黄瓜及香瓜的OCT蛋白亲缘性较近,相似度分别达92%和93%。3、重组OCT的包涵体蛋白在大肠杆菌表达系统中最佳诱导表达条件:诱导起始OD600为0.6、IPTG浓度为0.6 mmol/L、诱导时间为10 h及诱导温度为32℃。对纯化后的包涵体蛋白进行复性,复性率达42.55%,且该复性蛋白具有活性。