内含子miR-483与宿主基因IgF2表达与功能关系的研究

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目的:microRNAs是生物体内一类重要的基因表达调控分子,其中大部分由其他基因的内含子所编码,称为“内含子microRNAs”,其所在基因称为“宿主基因”。由于其编码位置的特殊性,它们与宿主基因在表达和功能上的关系引起研究者极大的兴趣。有研究显示一些内含子microRNAs可促进宿主基因的表达并“帮助”其宿主基因编码产物发挥作用,也有研究表明另一些内含子microRNAs具有抑制宿主基因表达的作用。内含子miR-483由胰岛素样生长因子2基因(Igf2)的第二内含子编码,后者的蛋白产物参与机体器官发育、糖脂代谢、肿瘤发生发展等多种生物学过程。本研究旨在阐明内含子miR-483与Igf2在表达和功能上的关系,为以miR-483为靶点的临床分子治疗提供依据、为理解内含子的功能提供参考。  方法:首先,建立基于质粒载体的miR-483过表达与敲减系统;其次,通过qRT-PCR检测不同细胞系及小鼠不同组织中miR-483与Igf2的表达水平;在小鼠肝癌细胞Hepa1-6中应用Igf2转录水平抑制剂,检测miR-483与宿主基因Igf2的表达情况证实二者具有“共表达”的性质。再次,在干扰miR-483含量后,通过细胞生长曲线、软琼脂克隆形成实验等观察其对肝癌细胞增殖的影响,并通过荧光素酶活性实验验证其直接靶向细胞因子信号抑制因子3(Socs3)基因的3UTR区,证实miR-483具有促进Hepa1-6细胞增殖的作用。最后,为进一步研究其生物学功能,本研究通过小鼠受精卵原核显微注射的方法建立了两种转基因小鼠模型,分别从“得功能”和“失功能”正反两个角度初步观察了miR-483对小鼠不同组织的影响。  结果:(1)miR-483干扰质粒能够有效调节细胞内miR-483的含量;(2)细胞内miR-483含量随Igf2的mRNA含量降低而降低,小鼠不同组织内二者含量也呈高度正相关;(3)miR-483具有促进小鼠肝癌细胞增殖的作用;(4)两种转基因小鼠可以将外源基因稳定的遗传给子代小鼠,其不同组织中miR-483被有效干扰,并出现部分表型变化,该转基因小鼠能够用于后续在体功能研究。  结论:(1)miR-483干扰质粒建立成功,并证实miR-483与Igf2基因在Hepa1-6细胞株中具有“共表达”模式;(2)miR-483具有促进Hepa1-6细胞增殖和迁移的作用,这种作用部分是通过靶向Socs3的3’UTR区实现的;(3)建立了全身广泛表达的miR-483转基因过表达和敲减小鼠,证实“microRNA海绵”策略可有效的在体表达并发挥对miR-483的敲减作用。本研究提出了“内含子microRNA是作为宿主基因的伙伴(Partner)而发挥生物学作用”的理论,为理解内含子microRNAs与宿主基因之间的调控网络提供了实验基础。
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