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鱼类属于低等水生变温脊椎动物,其生命活动容易受到水体温度变化的影响。尖头大吻鱥(Rhynchocypris oxycephalus)是一种典型的冷水性小型鱼类,对温度变化非常敏感。研究表明随着全球气候变暖,尖头大吻鱥的生态分布范围将缩小,其生存将面临着严峻的挑战。研究和弄清尖头大吻鱥对温度升高和应激响应的分子机制,对于理解该鱼温度适应将具有重要意义。本文以冷水性鱼类尖头大吻鱥为研究对象,通过基因克隆获得HSP60、HSP70和HSP90 cDNA全序列,分析了其基因序列特征,并对热应激处理下热休克蛋白基因及免疫相关一些基因的表达响应进行研究。本论文主要研究结果如下:1.本文采用RT-PCR和RACE技术克隆获得了尖头大吻鱥HSP60、HSP70、HSP90β1和HSP90β2基因的cDNA全长序列。HSP60基因cDNA全长为2300 bp,5′-UTR 97 bp,3′-UTR 475 bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)1728 bp,编码氨基酸575个;理论等电点5.91,分子量61.25 kDa;该氨基酸序列含有线粒体HSP60标签序列AAVEEGIVPGG(氨基酸位置430-441,下同),C端有GGM重复序列;经系统发育分析显示其与草鱼、团头鲂的亲缘关系最近,与多种鱼类同源性达90%以上。HSP70 cDNA全长2238 bp,5′-UTR为43 bp,3′-UTR 272 bp,开放阅读框为1923 bp,编码氨基酸640个;理论等电点5.35,分子量70.27 kDa;其氨基酸序列含有3个HSP70家族标签序列:IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL和IVLVGGSTRIPKIQK(依次为9-16、197-210和334-348),含有胞质HSP70特征基序EEVD(637-640),双分型核定位信号序列KRKHKKDISDNKRAVRRL(246-263)以及C端有一个GGMP(612-615)四肽简并序列;序列同源性分析发现,与鲤和唐鱼同源性较高。HSP90βcDNA在尖头大吻鱥中存在两个成员,分别为HSP90β1和HSP90β2。HSP90β1 cDNA全长2657 bp,5′-UTR 86 bp,3′-UTR381 bp,开放阅读框为2190 bp,编码氨基酸729个;理论等电点为4.89,分子量83.78 kDa;该蛋白含有HSP90家族的1个标签序列即YSNKEIFLRE(32-41),含有双分型核定位信号序列RRAPFDLFENKKKKN(340-354),胞质特征基序MEEVD(725-729);序列同源性分析发现,与鲤和团头鲂有较高的同源性。HSP90β2全长2674 bp,5′-UTR 86 bp,3′-UTR 413 bp,开放阅读框为2175 bp,编码氨基酸724个;理论等电点4.89,分子量为83.2 kDa;含有HSP90家族的1个标签序列即YSNKEIFLRE(32-41),核定位信号RRAPFDLFENKKKKN(335-349),及胞质特征基序MEEVD(719-724);同源性分析显示与鲤和团头鲂同源性达97%以上。2.将尖头大吻鱥随机分组,分别饲养在11℃、16℃、21℃和26℃水体中,11℃设为对照组温度,每组3个平行。实验开始后分别在0、1、3、6、12、24、48和96 h取肝、鳃、脑和脾,对于不同处理组热应激96 h后,解除热应激恢复72 h后也进行取样检测。qRT-PCR方法测定基因HSP60、HSP70、HSP90β1、HSP90β2以及C3、NF-κB2和MHCⅡB在mRNA水平上的表达变化。结果显示:热休克蛋白基因HSP60、HSP70、HSP90β1、HSP90β2在热应激处理后呈现不同的表达变化。16℃应激下,各基因均有一定程度上调表达,说明在16℃热应激下,热休克蛋白基因表达量随时间延长而上升。21℃和26℃组,HSP60、HSP70、HSP90β1和HSP90β2在不同组织中的的表达趋势为先上升后下降趋势,表明这些基因参与了保护机体免受伤害的防护机制并发挥重要作用,尤其是HSP70表达显著。不同组织中基因的表达模式存在特异性。在26℃热应激中,HSP60脾脏表达量最高,而HSP70是肝脏最高,HSP90β1和HSP90β2表达量最高的组织均是鳃;而HSP60的表达量峰值在脾和脑中先出现,HSP70脑中先出现,而HSP90β的两个成员在脾脏中最早出现,4个基因在肝脏中表达峰值出现均较晚;在热应激后的恢复阶段,26℃组中HSP70、26℃组中HSP60在肝脏中表达以及HSP90β1和HSP90β2在脑中表达量均未恢复到应激前的水平。这种变化可能与这些组织对热应激的耐受性和各自承担的生理功能有关。免疫相关基因C3、NF-κB2和MHCⅡB在16℃应激下大多没有明显的表达变化;21℃和26℃应激下,尖头大吻鱥C3、NF-κB2和MHCⅡB均有一定的上调表达,特别是26℃应激组上调表达明显,显示热应激可促进这些基因的转录表达,从而增强机体免疫能力。