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【研究背景及研究目的】非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）已经成为世界上最常见的慢性肝脏疾病之一,约30%的成年人罹患此类疾病,其所造成的肝脏损伤主要与胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）以及代谢应激性肝损伤有关,疾病谱从单纯性非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fat liver,NAFL）到非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis,NASH）,并随着病情的发展,逐渐发展成肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）。NAFLD不仅可以导致严重的肝脏损伤,还与代谢综合征（metabolic syndrome,Met S）、冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart disease,CHD）、2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）以及肠道肿瘤的高发密切相关,同时,越来越多的慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B virus,CHB）感染患者亦合并NAFLD,严重危害我国人民的生命健康。而NASH作为NAFLD中最关键的进展阶段,和单纯性非酒精性脂肪肝相比,其发展为肝硬化、肝癌等终末期肝病的风险为后者的30-50倍甚至更高。因其发病机制复杂,目前临床上针对NASH尚无有效的治疗靶点以及早期的预测指标。因此,深入探究NASH的发病机制,为今后临床上寻求有效的干预靶点提供科学依据就显得尤为重要。肝脏是人体最大实质性器官,同时也是重要的免疫器官,在人体的天然免疫调节中发挥关键作用。巨噬细胞是天然免疫中关键的组成部分,肝脏免疫微环境中的巨噬细胞主要由肝脏固有的巨噬细胞,即Kupffer细胞（Kupffer cells,KCs）以及单核细胞衍生的巨噬细胞（monocyte derived macrophages,MDMs）组成。在NAFLD发展到NASH的过程中,肝脏内巨噬细胞明显活化,主要向M1型巨噬细胞分化,释放大量的促炎因子以及活性氧（reactive oxygen species,ROS）,进一步加重了肝脏内脂质过氧化、胰岛素抵抗等病理过程,诱发肝脏微环境网络化损伤的恶性循环,使肝脏功能明显受损。因此,深入研究肝脏巨噬细胞在NASH中的作用机制有重要意义。巨噬细胞在肝脏中的调控机制极为复杂,寻找可以调控巨噬细胞功能的靶向分子是研究的关键。纤维介素蛋白2（fibrinogen-like protein 2,fgl2）,亦称凝血酶原酶,是纤维蛋白原超家族中参与调控机体凝血功能以及免疫调节功能的重要成员。研究者所在实验室前期研究发现,fgl2高表达于活化的巨噬细胞,在暴发性肝炎小鼠模型以及重型乙型肝炎患者肝脏组织当中,fgl2的表达量均明显增高。因此,在此前fgl2相关研究的基础上,本研究利用NASH小鼠模型、体外原代巨噬细胞培养,结合临床标本,对fgl2在巨噬细胞上的作用机制进行深入的研究,为今后NASH的诊断以及治疗提供新的线索。【研究方法】1.通过患者肝脏组织HE染色以及NAFLD评分（NAFLD activity score,NAS）诊断NASH,并在肝脏组织切片中标记CD68、fgl2,利用免疫荧光技术观察NAFL以及NASH患者肝脏中CD68+巨噬细胞以及fgl2的表达,并进一步观察CD68+和fgl2的共表达情况。动物实验方面,利用蛋氨酸-胆碱缺乏（methionine choline deficient,MCD）饮食以及高脂饮食（high fat diet,HFD）构建NASH小鼠模型,定期监测体重;免疫荧光观察小鼠肝脏内F4/80+巨噬细胞以及fgl2表达;2.利用小鼠肝脏组织HE染色以及NAFLD评分评估野生型（wild type,WT）和fgl2敲除（fgl2 knockout,fgl2-/-）小鼠肝脏病理变化,外周血谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（aspartate transaminase AST）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）用来评估小鼠肝脏功能,同时检测肝脏内促炎因子TNF-a、IL-6、IL-1b、MCP-1和IL-18的分泌以及ROS的活化;3.利用油红染色判断肝脏脂肪变性程度,检测肝脏内以及外周血胆固醇（cholesterol,CHOL）、甘油三酯（triglyceride,TG）水平;利用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）以及游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）刺激骨髓来源的巨噬细胞（bone marrow derived macrophages,BMDMs）构建体外NASH模型;LPS、FFA条件培养基（conditioned medium,CM）与原代肝细胞共培养,实时定量PCR（quantitative real-time PCR,q PCR）检测肝脏组织以及原代肝细胞中固醇调节元件结合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2,SREBP-2）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,Fasn）、过氧化物酶体增殖物激活受体a（peroxisome proliferator-activated receptor a,PPARa）以及肉毒碱棕榈酰基转移酶1A（carnitine palmitoyl transferase 1a,CPT1A）基因表达;4.免疫印迹实验（Western Blot,WB）检测肝脏组织以及BMDMs内核因子活化B细胞k轻链增强子（molecules like nuclear factor-k B,NF-k B）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38-mitogen-activated protein kinase,p38-MAPK）信号通路磷酸化水平以及NOD样受体蛋白3（NOD-like receptors protein 3,NLRP3）炎性小体活化状态;5.利用HBLV-h-Fgl2-GFP-PURO慢病毒对THP-1细胞进行fgl2过表达,Western Blot检测肝脏组织以及THP-1细胞内Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）及其下游信号分子髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88,My D88）和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNF receptor associated factor,TRAF6）表达;免疫共沉淀（coimmunoprecipitation,Co IP）检测fgl2与TLR4结合的情况。【研究结果】1.在NASH患者和小鼠模型中,肝脏巨噬细胞数量与肝脏中fgl2表达均较对照组显著增加,同时巨噬细胞上fgl2表达也明显增加;2.敲除fgl2可减轻饮食诱导的NASH小鼠肝脏炎症以及脂肪变性。与野生型NASH小鼠相比,fgl2-/-NASH小鼠的肝脏组织NAFLD评分明显降低,肝功能指标ALT,AST以及LDH明显改善,肝脏组织以及fgl2-/-BMDMs中促炎细胞因子TNF-a、IL-6、IL-1b、MCP-1、IL-18和ROS活化水平均明显降低;3.相比于野生型,fgl2-/-NASH小鼠脂质合成相关基因（Fasn,SREBP-2）表达下调,肝脏脂质代谢相关基因（PPARa,CPT1A）表达上调,致使fgl2-/-NASH小鼠肝脏组织中脂质沉积减少;同样,用fgl2-/-BMDMs条件培养基共培养的原代肝细胞内脂质沉积较WT组少,原代肝细胞内脂质合成与代谢基因的变化与小鼠肝脏组织一致;4.敲除fgl2后,NASH小鼠肝脏组织中NF-k B、p38-MAPK和NLRP3炎症小体的激活也受到抑制,致使下游相关炎性因子激活减弱;5.进一步实验结果表明,fgl2可以与TLR4结合并介导TLR4-Myd88依赖性信号通路的激活,继而导致随后的炎症发展和脂质代谢紊乱。【研究结论】在NASH疾病过程中,fgl2可通过与巨噬细胞上的TLR4结合,通过TLR4-Myd88依赖性信号途径,激活下游NF-k B、p38-MAPK信号通路和NLRP3炎症小体,从而导致TNF-a、IL-6、IL-1b、MCP-1、IL-18等促炎因子释放和ROS的过度产生,影响脂质合成与代谢相关基因,引起肝脏内脂质代谢紊乱,从而促进NASH的进展。