【摘 要】
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PRSS2基因编码丝氨酸蛋白酶2,是胰蛋白酶家族中的重要成员,并以丝氨酸为活性中心发挥水解蛋白的作用。目前,关于PRSS2基因的研究主要集中于胰腺炎和癌症方面,但是本课题组前期的转录组学分析发现PRSS2基因在高乳脂和低乳脂的中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞中差异表达,其遗传多态性与乳品质性状显著相关,这提示PRSS2基因可能对于奶牛乳脂性状具有调控作用。因此,本试验以PRSS2基因为研究对象,采用生物
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PRSS2基因编码丝氨酸蛋白酶2,是胰蛋白酶家族中的重要成员,并以丝氨酸为活性中心发挥水解蛋白的作用。目前,关于PRSS2基因的研究主要集中于胰腺炎和癌症方面,但是本课题组前期的转录组学分析发现PRSS2基因在高乳脂和低乳脂的中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞中差异表达,其遗传多态性与乳品质性状显著相关,这提示PRSS2基因可能对于奶牛乳脂性状具有调控作用。因此,本试验以PRSS2基因为研究对象,采用生物信息学分析、RNA干扰和过表达、RT-q PCR和Western Blot等分子生物学技术,在奶牛乳腺上皮细胞中探讨其表达机制及对乳脂代谢的调控作用,为PRSS2基因在奶牛乳脂性状育种中的应用提供分子依据,并为其他重要性状功能基因的研究及在分子育种中的应用提供借鉴。本研究的结果如下:以奶牛乳腺上皮细胞c DNA为模板,利用PCR技术获取PRSS2基因的CDS区序列,并对PRSS2基因进行了生物信息学的分析,结果发现:PRSS2基因存在两个转录本,一个长度为744 bp（PRSS2-1）,另一个长度为583 bp（PRSS2-2）;生物信息学分析显示PRSS2-2转录本的m RNA二级结构最小自由能减少,结构稳定性下降,且转录提前出现终止密码子而可能翻译成一个小肽。以中国西门塔尔牛、雷琼黄牛和四川牦牛c DNA为模板,进行PRSS2基因的扩增,结果表明上述三个品种中PRSS2基因也具有两个转录本。以PRSS2基因的两个转录本为对象,构建了两个转录本的过表达载体,转染牛乳腺上皮细胞,实验结果表明:在空白组奶牛乳腺上皮细胞中PRSS2-2转录本m RNA表达水平较PRSS2-1转录本的m RNA表达水平显著升高（P＜0.05）;过表达PRSS2基因两个转录本均显著降低了细胞内甘油三酯和胆固醇,但PRSS2-1转录本比PRSS2-2转录本的作用效果更明显（P＜0.05）。以PRSS2基因的PRSS2-1转录本为对象,分别构建过表达和干扰载体。将两个载体转染至奶牛MECs中,结果表明:PRSS2基因的过表达能显著降低细胞内的甘油三酯和胆固醇的含量（P＜0.05）,显著增加游离脂肪酸含量（P＜0.05）;PRSS2基因的沉默则显著促进细胞内的甘油三酯和胆固醇的合成（P＜0.05）,显著抑制游离脂肪酸的蓄积（P＜0.05）;使用气相-质谱的方法检测了细胞中脂肪酸组成,结果显示:过表达PRSS2基因能显著降低C17:1N7（十七碳烯酸）和C22:4N6（二十二碳四烯酸）的含量（P＜0.05）;PRSS2基因的沉默显著增加C17:1N7（十七碳烯酸）和C22:4N6（二十二碳四烯酸）的含量（P＜0.05）。以AMPK信号通路为研究对象,检测了该通路中与脂代谢相关基因的表达情况,RT-q PCR的结果表明,PRSS2基因的过表达能显著上调GSK3B、HSL、ACSS2、SCD1、CPT1A、Leptin和AMPKα1基因的表达,而显著下调SREBP1基因的表达;PRSS2基因的沉默能显著下调GSK3B、HSL、ACSS2、SCD1、CPT1A、Leptin和AMPKα1（P＜0.05）,上调SREBP1基因的m RNA表达水平,但不显著;Western Blot结果进一步表明:过表达PRSS2基因能显著上调Leptin和AMPKα1的表达（P＜0.05）,而显著下调SREBP1的表达（P＜0.05）。综上所述,本试验首次发现了牛PRSS2基因的另一个转录本,长度为583 bp。同时,首次验证了PRSS2基因可能通过调节Leptin/AMPKα1/SREBP1通路促进乳腺上皮细胞中脂肪酸的合成而减少了甘油三酯和胆固醇的蓄积。
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