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肠道菌群与肠屏障具有紧密联系。课题组前期研究 发现，“杜长大”仔猪在接受外源粪菌移植后，肠道菌群组成发生改变，肠屏障功能改善，提示粪菌移植有促进仔猪肠道健康的潜在作用。本研究在此基础上进一步探讨粪菌移植对肠道菌群代谢及免疫应激诱导的肠上皮损伤的影响，试验采用16S高通量测序和基于质谱平台的代谢组学检测技术分析肠道菌群代谢功能的变化，并运用Western Blot、免疫荧光和免疫组化等技术检测肠上皮细胞增殖与凋亡、细胞间连接的表达与分布及炎性细胞因子的表达，旨在以肠道菌群的代谢功能为切入点，揭示粪菌移植调节受体仔猪肠黏膜屏障功能的潜在机制。
将30头同日出生、胎次相同的1日龄“杜长大”三元杂交仔猪按照遗传背景和初生重随机分为两部分，其中12头从出生到14日龄隔天灌喂1.5ml金华猪粪菌悬液（粪菌移植组），18头灌喂等量无菌PBS缓冲液（对照组）;15日龄时将粪菌移植组仔猪随机等分为两组，对照组仔猪随机等分为三组，其中选取粪菌移植组和对照组仔猪中各一组进行肠道微生物组和代谢组学检测，粪菌移植组仔猪剩余一组腹腔注射脂多糖(LPS)溶液（免疫应激+粪菌移植组），对照组仔猪剩余两组分别腹腔注射LPS溶液（免疫应激组）和等量生理盐水（空白对照组）。试验结束后屠宰所有仔猪，采集肠道内容物、肠道组织和肠黏膜样品进行后续检测。
主要研究结果如下:
1.仔猪增重和腹泻率
粪菌移植组仔猪平均日增重高于对照组(P＜0.05);两组间腹泻率无变化(P＞0.05)。
2.肠道菌群多样性和组成
与对照组相比，粪菌移植组肠道菌群在OTU水平的Observed species、Chao1、Shannon和Simpson指数均无显著变化，而在纲和目水平的Chao1、ACE和Simpson指数均显著升高;在门和科水平的肠道菌群丰度指数具有升高趋势。在肠道菌群β多样性方面，Anosim分析的R值为0.596，P值为0.004;主坐标分析(PCoA)和非度量多维尺度分析(NMDS)显示，粪菌移植组各样本与对照组均相互分离，表明受体仔猪肠道菌群结构发生了显著变化。
在门水平，厚壁菌门(Firmicutes)是粪菌移植组最丰富的门，其次是拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria);在属水平，粪菌移植显著改变了肠道39种菌属的相对丰度，其中Adhaeribacter、小单孢菌属（Micromonospora）和单胞菌属(Arenimonas)等21种菌属相对丰度显著提高，真杆菌属(Eubacterium)、Butyricicoccus和拟杆菌属（Bacteroides）等18种菌属相对丰度降低。
3.肠道形态和肠黏膜屏障
粪菌移植仔猪受LPS免疫应激后，隐窝深度显著高于空白对照组和免疫应激组，隐窝深度/组织厚度显著高于免疫应激组且与空白对照组相比无显著差异;电镜下观察到，免疫应激组肠黏膜M细胞数量增加、细胞间连接和微绒毛数量减少且微绒毛高度降低，而粪菌移植仔猪受LPS免疫应激后结肠黏膜M细胞数量未见增多，微绒毛数量和高度及细胞间连接分布与空白对照组类似。
粪菌移植显著缓解了LPS诱导的肠上皮Ki67+细胞及紧密连接蛋白ZO-1与黏附连接蛋白β-catenin的减少，提高了免疫应激仔猪肠上皮黏附连接蛋白E-cadherin和肠黏膜TGF-β1mRNA表达量，降低了趋化因子Mcp-1和炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的表达量。
4.肠道菌群代谢及黏膜相关基因表达
粪菌移植显著改变了受体仔猪肠腔中40种代谢物，包括碳水化合物、脂肪酸、二肽、胆汁酸和吲哚衍生物等，其中二肽类物质含量显著降低，氨基酸次生代谢物显著增加;参与脂肪酸代谢的4种物质显著增加;代谢物富集分析结果显示，色氨酸代谢是组间差异最显著的代谢通路，其次是胆汁酸生物合成和磷脂生物合成。
代谢物靶向定量结果显示，粪菌移植组肠腔中吲哚乙酸浓度显著高于对照组;结肠黏膜色氨酸代谢相关基因表达结果显示，粪菌移植组仔猪结肠黏膜囊泡单胺转运体1（VMAT1）基因表达显著增加，吲哚胺2，3-双加氧酶1(IDO1)基因表达有增加趋势，而色氨酸羟化酶(TPH1)和芳香酸脱羧酶（AADC）基因表达均无显著变化。
5.肠道菌群功能预测
与对照组相比，粪菌移植组中57种KEGG第三层级预测功能发生显著变化。其中，“吲哚生物碱生物合成”、“细胞色素P450”、“紧密连接”和“黏附连接”四种功能所占比例显著提高，“细菌毒素”功能所占比例显著降低;基于LEfSe的肠道菌群差异功能分析结果显示，粪菌移植组中“不饱和脂肪酸生物合成”所占比例显著升高，“脂多糖生物合成”所占比例显著降低。
Spearman相关性分析结果显示，来源于拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、奇古菌门(Thaumarchaeota)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和浮霉菌门(Planctomycetes)的10种菌属与“吲哚生物碱生物合成”、“细胞色素P450”、“Notch信号通路”、“Wnt信号通路”及细胞进程相关功能“紧密连接”和“黏附连接”呈显著正相关。
6.菌群代谢物下游通路变化
与对照组相比，粪菌移植组肠黏膜IL-22、IL-22靶基因Fos及IL-22RA1mRNA相对表达量显著提高，运用Western Blot在蛋白水平验证了肠黏膜IL-22及其受体合成的增加;芳香烃受体（AhR）及其靶基因的表达检测表明，粪菌移植组仔猪肠黏膜AhR及其伴侣分子Arnt在转录和蛋白水平的相对表达量均显著高于对照组，且AhR靶基因CYP1A1相对表达量显著降低，而CYP1A2、CYP1B1及刺激IL-22分泌的细胞因子IL-23的相对表达量无明显变化。
上述结果表明:粪菌移植能促进受体仔猪增重;提高肠道菌群在纲和目水平的α多样性，并改变肠道微生物群落的组成和结构;显著缓解LPS诱导的肠上皮损伤和屏障功能的破坏并抑制炎性免疫应答;明显改变受体仔猪肠道菌群代谢组、提高色氨酸代谢产物吲哚-3-乙酸含量并改变宿主色氨酸代谢相关基因的表达;改变肠道菌群功能，且10种差异菌属与预测功能“吲哚生物碱生物合成”、“细胞色素P450”、“Notch信号通路”、“Wnt信号通路”及细胞进程相关功能“紧密连接”和“黏附连接”呈显著正相关;激活肠黏膜“AhR-IL-22”轴相关组分的表达。结果提示，粪菌移植能显著缓解LPS诱导的肠上皮损伤，改变肠道菌群功能及其代谢组，其对肠道菌群色氨酸代谢产物吲哚-3-乙酸及其下游信号通路“AhR-IL-22”轴的调节可能在受体仔猪肠屏障功能的提升中发挥重要作用。
将30头同日出生、胎次相同的1日龄“杜长大”三元杂交仔猪按照遗传背景和初生重随机分为两部分，其中12头从出生到14日龄隔天灌喂1.5ml金华猪粪菌悬液（粪菌移植组），18头灌喂等量无菌PBS缓冲液（对照组）;15日龄时将粪菌移植组仔猪随机等分为两组，对照组仔猪随机等分为三组，其中选取粪菌移植组和对照组仔猪中各一组进行肠道微生物组和代谢组学检测，粪菌移植组仔猪剩余一组腹腔注射脂多糖(LPS)溶液（免疫应激+粪菌移植组），对照组仔猪剩余两组分别腹腔注射LPS溶液（免疫应激组）和等量生理盐水（空白对照组）。试验结束后屠宰所有仔猪，采集肠道内容物、肠道组织和肠黏膜样品进行后续检测。
主要研究结果如下:
1.仔猪增重和腹泻率
粪菌移植组仔猪平均日增重高于对照组(P＜0.05);两组间腹泻率无变化(P＞0.05)。
2.肠道菌群多样性和组成
与对照组相比，粪菌移植组肠道菌群在OTU水平的Observed species、Chao1、Shannon和Simpson指数均无显著变化，而在纲和目水平的Chao1、ACE和Simpson指数均显著升高;在门和科水平的肠道菌群丰度指数具有升高趋势。在肠道菌群β多样性方面，Anosim分析的R值为0.596，P值为0.004;主坐标分析(PCoA)和非度量多维尺度分析(NMDS)显示，粪菌移植组各样本与对照组均相互分离，表明受体仔猪肠道菌群结构发生了显著变化。
在门水平，厚壁菌门(Firmicutes)是粪菌移植组最丰富的门，其次是拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria);在属水平，粪菌移植显著改变了肠道39种菌属的相对丰度，其中Adhaeribacter、小单孢菌属（Micromonospora）和单胞菌属(Arenimonas)等21种菌属相对丰度显著提高，真杆菌属(Eubacterium)、Butyricicoccus和拟杆菌属（Bacteroides）等18种菌属相对丰度降低。
3.肠道形态和肠黏膜屏障
粪菌移植仔猪受LPS免疫应激后，隐窝深度显著高于空白对照组和免疫应激组，隐窝深度/组织厚度显著高于免疫应激组且与空白对照组相比无显著差异;电镜下观察到，免疫应激组肠黏膜M细胞数量增加、细胞间连接和微绒毛数量减少且微绒毛高度降低，而粪菌移植仔猪受LPS免疫应激后结肠黏膜M细胞数量未见增多，微绒毛数量和高度及细胞间连接分布与空白对照组类似。
粪菌移植显著缓解了LPS诱导的肠上皮Ki67+细胞及紧密连接蛋白ZO-1与黏附连接蛋白β-catenin的减少，提高了免疫应激仔猪肠上皮黏附连接蛋白E-cadherin和肠黏膜TGF-β1mRNA表达量，降低了趋化因子Mcp-1和炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的表达量。
4.肠道菌群代谢及黏膜相关基因表达
粪菌移植显著改变了受体仔猪肠腔中40种代谢物，包括碳水化合物、脂肪酸、二肽、胆汁酸和吲哚衍生物等，其中二肽类物质含量显著降低，氨基酸次生代谢物显著增加;参与脂肪酸代谢的4种物质显著增加;代谢物富集分析结果显示，色氨酸代谢是组间差异最显著的代谢通路，其次是胆汁酸生物合成和磷脂生物合成。
代谢物靶向定量结果显示，粪菌移植组肠腔中吲哚乙酸浓度显著高于对照组;结肠黏膜色氨酸代谢相关基因表达结果显示，粪菌移植组仔猪结肠黏膜囊泡单胺转运体1（VMAT1）基因表达显著增加，吲哚胺2，3-双加氧酶1(IDO1)基因表达有增加趋势，而色氨酸羟化酶(TPH1)和芳香酸脱羧酶（AADC）基因表达均无显著变化。
5.肠道菌群功能预测
与对照组相比，粪菌移植组中57种KEGG第三层级预测功能发生显著变化。其中，“吲哚生物碱生物合成”、“细胞色素P450”、“紧密连接”和“黏附连接”四种功能所占比例显著提高，“细菌毒素”功能所占比例显著降低;基于LEfSe的肠道菌群差异功能分析结果显示，粪菌移植组中“不饱和脂肪酸生物合成”所占比例显著升高，“脂多糖生物合成”所占比例显著降低。
Spearman相关性分析结果显示，来源于拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、奇古菌门(Thaumarchaeota)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和浮霉菌门(Planctomycetes)的10种菌属与“吲哚生物碱生物合成”、“细胞色素P450”、“Notch信号通路”、“Wnt信号通路”及细胞进程相关功能“紧密连接”和“黏附连接”呈显著正相关。
6.菌群代谢物下游通路变化
与对照组相比，粪菌移植组肠黏膜IL-22、IL-22靶基因Fos及IL-22RA1mRNA相对表达量显著提高，运用Western Blot在蛋白水平验证了肠黏膜IL-22及其受体合成的增加;芳香烃受体（AhR）及其靶基因的表达检测表明，粪菌移植组仔猪肠黏膜AhR及其伴侣分子Arnt在转录和蛋白水平的相对表达量均显著高于对照组，且AhR靶基因CYP1A1相对表达量显著降低，而CYP1A2、CYP1B1及刺激IL-22分泌的细胞因子IL-23的相对表达量无明显变化。
上述结果表明:粪菌移植能促进受体仔猪增重;提高肠道菌群在纲和目水平的α多样性，并改变肠道微生物群落的组成和结构;显著缓解LPS诱导的肠上皮损伤和屏障功能的破坏并抑制炎性免疫应答;明显改变受体仔猪肠道菌群代谢组、提高色氨酸代谢产物吲哚-3-乙酸含量并改变宿主色氨酸代谢相关基因的表达;改变肠道菌群功能，且10种差异菌属与预测功能“吲哚生物碱生物合成”、“细胞色素P450”、“Notch信号通路”、“Wnt信号通路”及细胞进程相关功能“紧密连接”和“黏附连接”呈显著正相关;激活肠黏膜“AhR-IL-22”轴相关组分的表达。结果提示，粪菌移植能显著缓解LPS诱导的肠上皮损伤，改变肠道菌群功能及其代谢组，其对肠道菌群色氨酸代谢产物吲哚-3-乙酸及其下游信号通路“AhR-IL-22”轴的调节可能在受体仔猪肠屏障功能的提升中发挥重要作用。