研究目的中国沙棘(Hippophae rhamnoides L.subsp.sinensisRousi),胡颓子科沙棘属植物沙棘(Hioppophae rhamnoides L.)的一个变种,自1977年被首次载入《中国药典》至今,具有健脾消食,止咳祛痰,活血散瘀等功效。西藏沙棘(H.tibetana Schlecht.)与沙棘(H.rhamnoides L.)相近,起初被合并在沙棘种内作异名,后因其形态特征、地理分布和生长环境都特殊,学者把它归为独立的种,是藏医、蒙医的习用药材,具有补肺,活血的功效,用于治月经不调、子宫病、胃病、肺结核、胃溃疡等,西藏北部的群众还用其治肝炎。沙棘作为一种药食同源植物,具有丰富的生物活性成分和营养物质。因《药典》中沙棘以果实入药,故一般开发产品利用的原料是其果实,而沙棘叶被当做废料遗弃;黄酮类成分是沙棘相关产品质量及其理化鉴别的重要衡量指标,而研究证实其在叶中含量最高,100 g干叶中为310-1238 mg(均值为792 mg,鲜果中均值为533 mg),每公顷的沙棘叶经计算,其年产量可多达5吨,废弃不用造成了极大的资源浪费;除此之外,相较于果实,沙棘叶还具有较高的产量、较长的收集周期、简单的生产加工工艺以及易于储藏等优势,通过对其叶中成分进行深入研究、合理利用,其发展前景是诱人的。因此,立足资源优势,本课题进行了以下研究:(1)建立中国沙棘和西藏沙棘叶中化学成分快速鉴定的分析方法,总结其质谱裂解规律,分析比较两沙棘叶中成分组成特征;(2)将LC-MS分析技术与代谢组学数据处理技术相结合,构建中国沙棘叶和西藏沙棘叶的区分模型并寻找造成两沙棘叶差异的特征性成分。(3)收集不同产地中国沙棘和西藏沙棘叶,建立两沙棘叶中黄酮苷的含量测定方法,分析、比较两沙棘叶中成分含量上的特征;(4)采用H202诱导PC12细胞建立氧化损伤模型,通过倒置显微镜观察细胞形态,MTT法测定了解PC12细胞损伤情况和存活率,初步分析中国沙棘和西藏沙棘叶不同极性部位以及沙棘总黄酮(TFH)对氧化损伤后的PC12细胞的保护作用,为其在神经退行性疾病临床治疗方面奠定基础。研究方法1.运用超高效液相串联四级杆飞行时间质谱的联用仪器(UPLC/Q-TOF-MS)建立中国沙棘和西藏沙棘叶中化学成分快速鉴定的分析方法,优化质谱条件,使得各成分裂解的碎片稳定,裂解信息全面;总结两沙棘叶中成分的质谱裂解规律,分析比较两沙棘叶中成分组成上的特征。2.实验首先基于超高效液相线性离子阱-串联静电场轨道阱质谱联用技术(UPLC-LTQ-Orbitrap-MS)对两沙棘叶中成分进行充分解析获得尽可能多的化合物,继而采用代谢组学数据处理手段对实验数据做降维处理以及包括PCA和PLS-DA等在内的统计学分析,用于两沙棘叶中差异性成分的研究以及两沙棘叶的鉴定。3.采用甲醇回流提取方法对多产地中国沙棘和西藏沙棘叶进行提取,运用高效液相(HPLC)建立两沙棘叶中黄酮苷的定量方法,并对样品进行测定,分析不同产区两沙棘叶中成分含量上的差异。4.通过分析不同浓度以及不同作用时间下,H202对PC12细胞存活的影响,建立H202诱导的PC12细胞氧化损伤模型,初步分析中国沙棘和西藏沙棘不同极性部位以及沙棘总黄酮(TFH)对氧化损伤后的PC12细胞的保护作用。结果与结论1.基于UPLC/Q-TOF-MS技术,结合质谱数据、文献数据以及与标准品比对,从两沙棘叶中分析、推断出35个化合物,其中,29个化合物为两沙棘叶共有成分,剩余的6个成分中,2个成分为中国沙棘叶特有,其余为西藏沙棘叶独有。结果表明,中国沙棘和西藏沙棘叶中成分组成上大体一致,主要是以槲皮素、山奈酚、异鼠李素为苷元和糖结合形成的黄酮醇苷类物质,糖基主要有葡萄糖、鼠李糖等,因此碎片离子以丢失[M-H-162]-和[M-H-146]-居多;对于黄酮母核,主要发生C环的RDA裂解和一些小分子碎片的丢失,如CO,CHO,C302,CO2等。总结沙棘叶中成分的质谱裂解特征,发现负离子模式,糖基化位置不同,苷元离子(Y0-)和自由基苷元离子[Y0-H]-丰度不同:黄酮醇3-O-单糖苷产生的[Yo-H]-·丰度强,黄酮醇7-O-单糖苷产生的Y0-丰度强;对于黄酮3,7-二-O-双糖苷类成分,可通过3-O苷键的均裂,失去自由基形式的糖,例如-G1c,形成[Y30-H]-离子;3,7位同时丢失糖基,形成[Y0-2H]-离子;除此之外,质量数不同的糖基,其连接位置可通过[M-H]-离子及特征离子[Y30-H]-·与[Y0-2H]-的质量数之差得到推断。利用Mass1ynx 4.1软件经去噪、基线校正、重叠峰解析及峰对齐获得了两种沙棘叶中35种化学成分的相对定量信息,结果表明,对于两沙棘叶的主要成分而言,中国沙棘约为西藏沙棘含量的1.5倍,6个特异性成分含量相对主成分而言含量很低。2.基于UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析技术,根据分子离子峰、保留时间及裂解碎片信息,并与文献报道的化学成分及对照品进行比对,共确定及推断出41个成分。运用代谢组学数据处理手段对数据进行主成分分析(PCA)及偏最小二乘判别分析(PLS-DA),其中,PCA 分析模型 R2X = 69.2%,Q2=53.6%;PLS-DA 分析模型 R2Y=99.9%,Q2 =98.5%,成功构建了中国沙棘叶和西藏沙棘叶的区分模型;此外,采用PLS-DA对数据做进一步分析,对VIP(变量性重要投影)>1的成分做配对t检验且以p<0.05的化合物作为两沙棘叶中差异性成分,经统计分析及综合前期鉴定的化合物,从中国沙棘和西藏沙棘叶中共分析得到10个特征性差异成分。3.基于HPLC法建立了不同产地的两沙棘叶中黄酮苷的含量测定方法,结果表明,不同产地的两沙棘叶中黄酮苷的含量存在较大差异。中国沙棘叶中黄酮苷含量均值为1.13%,而西藏沙棘叶中黄酮苷含量变化较大,于0.6%-1.4%之间波动,猜测该测定结果可能与西藏沙棘的原始生境相关,其常常分布于海拔5000米以上的高寒地区,而本实验中样品采集地的温度、光照、海拔以及紫外辐射等均与其原始生境相差较大,对其黄酮类成分的合成与积累产生较大影响。4.分析不同浓度以及不同作用时间下H2O2对PC12细胞存活率影响,实验结果表明,H2O2能够呈剂量和时间依赖性的损伤PC12细胞并降低其生存率,且采用300 μM的H2O2处理PC12细胞4 h时,和对照组相比,细胞活力下降至54.67%,表明造模成功。研究中国沙棘和西藏沙棘不同极性部位以及沙棘总黄酮(TFH)对氧化损伤后的PC12细胞的保护作用,结果表明,中国沙棘和西藏沙棘叶不同极性部位成分都能够不同程度的抑制H2O2氧化损伤导致的细胞活力下降,其活性顺序为:正丁醇部位<乙醇部位<乙酸乙酯部位,而且中国沙棘乙酸乙酯部位活性明显高于其他各极性部位。测定各极性部位中总黄酮含量,表明沙棘氧化应激活性与总黄酮含量呈正相关。将沙棘总黄酮(TFH)含量富集至29.63%,可显著提高氧化损伤细胞的生存率。其中,0.4,0.25 mg/mlTFH保护组同损伤组间有显著差异(p<0.05),对细胞有明显的保护作用,最大保护率达35.87%。