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海藻糖酶（EC3.2.1.28）是一种葡萄糖苷水解酶,可以催化一分子海藻糖水解生成两分子葡萄糖。在乙醇和谷氨酸发酵过程中,添加海藻糖酶可以提高发酵结束时乙醇和谷氨酸的产量,降低发酵液中的残糖含量,从而降低生产成本,具有较大的经济效益。同时,海藻糖酶还作为海藻糖不耐受病人的一种潜在治疗用酶和食品添加剂,但是目前报道的海藻糖酶重组表达水平普遍较低,尚没有海藻糖酶高产菌株的报道。本文以无孢黑曲霉HL-1为蛋白表达宿主,从六种丝状真菌中挖掘九个不同的海藻糖酶基因,并在黑曲霉中进行表达筛选,得到两个高活力海藻糖酶基因,通过利用CRISPR/Cas9技术、培养基优化、过表达AmyR（An04g06910）、Cog（An16g03450）、Sed（An16g03450）以及突变Ire A（An01g06550）的方法,构建出两株高活力海藻糖酶高产菌株,发酵液经凝胶过滤层析纯化后,研究其酶学性质并将应用于酵母乙醇发酵,主要研究内容如下:（1）构建黑曲霉蛋白表达通用载体,将启动子Pna II/TPI片段、不同海藻糖酶基因分别与线性化的通用表达载体连接,构建出9个不同海藻糖酶表达载体,转化宿主黑曲霉HL-1进行重组表达筛选,得到两个分别来源于Myceliophthora thermophile、Myceliophthora sepedonium的高活力的海藻糖酶基因MthT、TreM,相应转化子HL-MthT、HL-TreM发酵上清液中的酶活力分别为190.11 U/m L、406.44 U/m L。（2）通过应用CRISPR/Cas9技术得到海藻糖酶MthT、TreM多拷贝表达转化子Du-MthT、Du-TreM,转化子发酵上清液酶活力分别为646.93 U/m L、1943.06 U/m L,比转化子HL-MthT、HL-TreM分别提高了240.29%、378.07%。SDS-PAGE结果显示转化子Du-MthT的中性淀粉酶Amy A不再表达,转化子Du-TreM发酵上清液中目的蛋白TreM的含量明显增加。进一步优化发酵培养基后,转化子Du-MthT、Du-TreM发酵上清液中的酶活力达到1698.83 U/m L、4268.29 U/m L,与优化前相比,分别提高了162.52%、119.67%。（3）应用CRISPR/Cas9技术敲除转化子Du-MthT中的pyrG基因,得到转化子Du-MthT-ΔpyrG,实现pyrG筛选标记的重复利用。将构建好的AmyR、Cog、Sed过表达载体和Ire A突变替换载体转化Du-MthT-ΔpyrG,得到AmyR、Cog、Sed过表达转化子AmyR-MthT、Cog-MthT、Sed-MthT和Ire A突变转化子Ire A-MthT,转化子Sed-MthT、Ire A-MthT在优化后发酵培养基的最高酶活力达到2105.19 U/m L、2150.89 U/m L,比转化子Du-MthT分别提高了23.92%、26.61%。（4）通过凝胶过滤层析对转化子Du-MthT、Du-TreM的发酵液进行纯化,纯化后的海藻糖酶MthT、TreM分子量都约为100 k Da,比酶活分别为480.84 U/mg、679.09 U/mg,纯化过程回收率达到80%以上。海藻糖酶MthT的最适温度、最适p H分别为60℃、5.5,在50–55℃和p H 4.5–7.0范围内具有很好稳定性,Mg2+、Co2+、Mn2+和ADP对海藻糖酶MthT的酶活力具有明显的促进作用,高浓度的Cu2+和SDS则会显著抑制MthT的酶活力。海藻糖酶TreM在60℃、p H5.6条件下酶活力最大,在45–50℃和p H4.0–7.5范围内具有很好的稳定性,Co2+、Cu2+、Mn2+和ATP可以提高海藻糖酶TreM的酶活力,但高浓度的EDTA和SDS会抑制TreM的酶活力。以30%淀粉糖化液为原料的酵母乙醇发酵过程中,与对照组相比,添加海藻糖酶MthT可以提高最后的乙醇含量,产量达到15.32%,使得发酵过程的葡萄糖乙醇转化率（乙醇产量/总葡萄糖含量）由34.38%提高到51.88%。