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本文以孕17～19天的SD大鼠为实验材料，用玻璃化方法对胚脑细胞进行冻存。通过检测细胞的回收率、存活率和线粒体内琥珀酸脱氢酶（SDH）的活性，筛选适合于胚脑细胞的玻璃化溶液和玻璃化冻存程序。对玻璃化冻存的胚脑细胞结构与功能进行检测，分析影响冻存后胚脑细胞活力的因素。在此基础上，对玻璃化冻存的胚脑细胞进行培养，检测培养后细胞的形态和功能变化。结果表明： （1）玻璃化冻存程序：用两步法对胚脑细胞进行预平衡，在室温（20℃）下将胚脑细胞放入50％浓度的玻璃化溶液中，平衡10min，然后把胚脑细胞移入4℃水浴中，继续加入玻璃化溶液，使其终浓度达到90％。平衡10min后，把细胞悬液分装入塑料冻存管中，直接投入液氮（-196℃）。在冻存3～60天后，取出细胞样品，立即投入38℃水浴中快速复温，然后用分步法洗脱冻存液。先用2.0M甘油+0.5M蔗糖溶液洗脱，离心后弃上清液，再用0.5M蔗糖洗脱，最后用新鲜D-Hank’s液洗脱三次。 （2）玻璃化溶液的筛选：从胚脑细胞的回收率、存活率和SDH活性的变化看，玻璃化溶液VS4对胚脑细胞的冻存效果最好，其成份为：20.5％（W／V）DMSO，15.5％（W／V）乙酰胺，10％（W／V）2,3-丁二醇和6％（W／V）蔗糖。用该溶液冻存的胚脑细胞在第3天时，回收率为91.00±2.48％，存活率为83.21±2.15％，SDH活性为0.494±0.005。从渗透性保护剂的作用效果看，DMSO+乙酰胺+丁二醇组合的效果最好，其次为DMSO+乙酰胺+丙二醇+丁二醇组合。从非渗透性保护剂的作用效果看，蔗糖对胚脑细胞的冻存效果优于聚乙二醇（MW 8000）。 （3）胚脑细胞玻璃化冻存后的结构与功能变化：从超微结构看，新鲜胚脑细胞膜表面光滑、膜结构完整，经过玻璃化溶液VS4预平衡后，细胞因脱去自由水而略有皱缩。在冻存后，部分细胞的细胞膜上会出现一些孔洞，在严重时还会出现细胞膜的破裂现象。在冻存过程中细胞回收率随冻存时间的延长而下降，但这种变化不显著（P＞0.05）。细胞存活率也出现随时间的延长而下降的趋势，冻存3天、7天、14天和21天的细胞存活率之间存在极显著差异（P＜0.01），30天后保持基本稳定，与60天比较无显著差异（P＞0.05）。胚脑细胞玻璃化冻存前期（3～30天）的检测结果表明，胚脑细胞内H2O2含量显著增加，SDH和SOD活性显著 浙江大学硕 士学位论义 降低，而玻璃化冻存后期（30～60天）HZOZ含量、SDH和 SOD活性趋于稳定。 表明玻璃化冻存方法适用于胚脑细胞的长期保存。 （4）冻存后的胚脑细胞培养：对玻璃化冻存后的胚脑细胞进行体外培养，观 察到胚脑细胞贴壁情况较差，贴壁时间较晚，但培养后细胞仍然能够正常生长、 分化，细胞长出突起，并交织成网状，与未经冻存的新鲜细胞生长相似。细胞内 的SDH活性比培养前显著提高拧＜0．05人 而HZOZ含量则显著降低（P＜0．05）， 说明培养过程对细胞的冷冻损伤具有一定的修复作用。 虽然胚脑细胞在冻存过程中，由于保护剂的毒性、降温一复温过程和冻存液 的洗脱等因素会对细胞的结构与功能造成一定的影响，但该技术仍能保持细胞较 高的活性，并适用于胚脑细胞的长期低温保存，而且某些在冻存过程中受损的细 胞可以通过短期培养进行修复，这为该项技术的实际应用提供了依据。