【摘 要】
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目的:评估二甲基亚砜、甘油、丙二醇、乙二醇四种冷冻保护剂在玻璃化法保存人指固有神经中的保护效果,筛选合适的人指固有神经冷冻保护剂,为人指固有神经的玻璃化法保存提供一定的理论依据。方法:取2018年10月到2020年10月在遵义医科大学第五附属（珠海）医院行截肢手术后病人放弃肢体的人指固有神经共75个片段,每段1cm,将75个片段随机分为5组（4个实验组,1个对照组）,每组15个片段,分别为:30%
【基金项目】
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珠海市医学科研项目（20191208A01007）；
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目的:评估二甲基亚砜、甘油、丙二醇、乙二醇四种冷冻保护剂在玻璃化法保存人指固有神经中的保护效果,筛选合适的人指固有神经冷冻保护剂,为人指固有神经的玻璃化法保存提供一定的理论依据。方法:取2018年10月到2020年10月在遵义医科大学第五附属（珠海）医院行截肢手术后病人放弃肢体的人指固有神经共75个片段,每段1cm,将75个片段随机分为5组（4个实验组,1个对照组）,每组15个片段,分别为:30%二甲基亚砜组、30%甘油组、30%乙二醇组、30%丙二醇组和空白对照组。实验组分别添加对应种类的冷冻保护剂使用玻璃化法于液氮（-196℃）中保存3周,空白对照组添加等体积浓度的无菌生理盐水使用玻璃化法在液氮（-196℃）中保存3周。复温后进行石蜡包埋切片,运用HE染色法观察人指固有神经的组织结构变化;应用钙黄绿素-AM（Calcien-AM）和碘化丙啶（Propidium iodide,PI）双染色激光共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope,LSCM）检测神经组织生物活性;ELISA法检测体外培养后的指固有神经片段的神经生长因子（Nerve growth factor,NGF）表达情况,应用统计学对各组间NGF浓度水平进行比较,分析各组间差异有无统计学意义。结果:1、HE染色结果:HE染色后光镜下观察见,空白对照组神经鞘膜结构模糊,神经纤维排列疏松、紊乱,局部有脱髓鞘改变;乙二醇组神经鞘膜基本完整,神经纤维排列整齐、紧凑;二甲基亚砜组神经鞘膜相对完整,神经纤维间存在间隙,但结构排列整齐;甘油组神经鞘膜偶见断裂,神经纤维结构较松散;丙二醇组神经鞘膜结构存在,完整性欠佳,神经纤维结构松散。2、激光共聚焦显微镜结果:Calcein-AM和PI双染色,LSCM观察见:空白对照组神经纤维绿色荧光（代表活细胞）轻度较弱,红色荧光（代表死细胞）强度较强,且广泛分布。各实验组绿色荧光较空白对照组均增强,红色荧光强度均减弱;实验组中乙二醇组绿色荧光强度最强,分布广泛,红色荧光最弱,分布范围有限;二甲基亚砜组次之;甘油组及丙二醇组神经荧光强度及分布情况相似,绿色荧光强度最弱,红色荧光强度最强。3、人NGF表达ELISA检测结果:实验组与空白对照组相比较,空白对照组NGF水平最低,各实验组NGF水平均较空白对照组明显增高,差异有统计学意义（P<0.05）。在实验组组间比较中,与乙二醇组比较,二甲基亚砜组、甘油组、丙二醇组NGF水平均较低,差异有统计学意义（P<0.05）;与二甲基亚砜组相比,乙二醇组NGF水平较高,差异有统计学意义（P<0.05）,甘油组及丙二醇组NGF水平较低,差异有统计学意义（P<0.05）;与甘油组相比,乙二醇组、二甲基亚砜组NGF水平较高,差异有统计学意义（P<0.05）,丙二醇组间比较无统计学差异（P>0.05）。与丙二醇组相比,乙二醇组、二甲基亚砜组NGF水平较高,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1、乙二醇、二甲基亚砜、甘油、丙二醇对人指固有神经的玻璃化法保存有保护作用。2、30%体积浓度下,乙二醇对人指固有神经的玻璃化法保存的保护效果较二甲基亚砜、甘油、丙二醇好。3、30%体积浓度下,甘油与丙二醇对人指固有神经玻璃化保存的保护效果相似。
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