干扰素是人和其他动物机体内非常重要的一种细胞因子,在特定诱导剂的作用下,由效应细胞产生并分泌,具有广谱抗病毒活性、抗肿瘤活性和调节免疫功能。按照国际通用的分类标准,干扰素主要分为三大类,即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中,IFN-γ属于Ⅱ型干扰素,而且Ⅱ型干扰素只包含IFN-γ—个成员。IFN-γ是由CD4+Th1、CD8+T细胞以及NK细胞受特异或非特异性抗原刺激后产生的糖蛋白,天然形式为N-糖基化的同源二聚体,具有一定的种属特异性。IFN-γ除了具有抗病毒活性之外,还参与免疫调节和MHC(主要组织相容性复合体)抗原的表达,也可以控制细胞生长。利用基因工程技术表达的干扰素与天然干扰素不仅在生物学活性方面高度相似,并且还具有纯度高、产量大、同批次产物质量稳定一致、适合规模化工业化生产等优点;更加重要的是,通过基因工程技术大规模生产干扰素能够大大降低经济成本,这一点对于在畜禽养殖业中大面积推广应用干扰素非常有利。本研究中,利用基因工程技术、分子生物学技术、蛋白组学技术等相关技术获得重组兔γ干扰素,研究其抗病毒功能以及制备单克隆抗体,为兔γ干扰素工业化生产以及临床应用奠定基础。利用RT-PCR技术从ConA刺激后的家兔外周血淋巴细胞中扩增兔γ干扰素(IFN-y)基因,获得大小约为504bp左右的目的片段。然后将其克隆、转化入pET-28a(+)原核表达载体上,构建重组载体pET-28a-IFN-γ。将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经过IPTG诱导、HisTrap亲和柱纯化获得大小约为18KDa左右的IFN-γ重组蛋白。大量表达重组兔IFN-γ蛋白,然后进行蛋白复性,从而获得有活性的IFN-γ蛋白。利用微量细胞病变抑制法测定重组兔IFN-γ蛋白的抗病毒效果。结果如下:(1)利用VERO细胞进行测定,重组兔IFN-γ蛋白抗VSV活性为2.51x103U/mL,蛋白浓度为 0.556mg/mL,比活性是 4.51×103U/mg。(2)利用MDCK细胞进行测定,重组兔IFN-y蛋白抗VSV活性为3.98×103U/mL,蛋白浓度为0.556mg/mL,比活性是7.16×103U/mg。结果表明,重组兔IFN-γ可以在体外抑制VSV对细胞的毒害作用。用纯化的重组兔IFN-γ蛋白免疫BALB/C小鼠,制备脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经过筛选和克隆化,共获得4株能稳定分泌兔IFN-γ单克隆抗体(mAbs)的杂交瘤细胞株,分别被命名为3H8、4G4、4F10、6C12,亚型分别为IgG1、κ链,IgG2b、κ链,IgG1、κ链,IgG1、κ链。分别制备单抗腹水,4株单抗腹水的间接ELISA效价在10-4-10-5之间;Western blot试验结果显示4株单抗均具有很好的特异性;相加ELISA试验显示3H8和4F10针对一个抗原识别位点,4G4和6C12识别另一个抗原识别位点。家兔IFN-γ单克隆抗体的制备,为研究和检测IFN-γ提供了一种重要的工具,也为研究家兔体内的免疫机制和免疫功能奠定基础。