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禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)属于正黏病毒科A型流感病毒属。根据其表面血凝素和神经氨酸酶的不同，可将其分为16种不同的HA亚型和9种NA亚型。自2013年以来，我国已发现H7N9亚型禽流感病毒，包括高致病性和低致病性病毒。H7N9亚型禽流感病毒感染人后死亡率高，大多数人感染病例都与活禽市场上的家禽有密切接触。因此，开发一种快速检测H7N9亚型禽流感病毒的检测技术是十分必要的。
本研究以差速离心法纯化的H7N9亚型禽流感病毒A/Chicken/Huizhou/HZ-3/2017(HP)免疫BALB/c小鼠，通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和间接ELISA对杂交瘤细胞进行筛选，建立稳定分泌H7N9亚型AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞25株，其中18株靶向HA蛋白(2A2、2H6、3A8、3E5、3H3、7A2、7H7、9B6、10A8、11B8、12F11、13C10、14C2、15C5、16D2、16F2、17A2和21E2)，1株靶向NA蛋白(12F12)，6株靶向NP蛋白(7D11、8A6、11A8、13A6、15E11和18A2)。IPMA测定单抗腹水效价在1×10-4～1×10-6之间。亚型鉴定结果显示，大部分单抗重链亚型为IgG1(10A8为IgG2a，2A2为IgG2b)，轻链均为κ链。病毒反应谱测定结果显示，18株H7-HA单抗和1株H7-NA单抗与2013～2017年分离得到的H7N9亚型AIV反应，而不与其它亚型流感病毒反应;6株H7-NP单抗与部分其它亚型流感病毒发生反应。血凝抑制(HI)和病毒微量中和试验结果显示，16株H7-HA单抗的HI效价在4log2～13log2之间，病毒中和效价在1∶500～1∶16000之间，另外2株H7-HA单克隆抗体不具有HI和中和活性。Western-blot检测结果表明，18株H7-HA杂交瘤细胞培养上清中有15株均在63KDa附近出现一条特异性的蛋白质条带，而另外3株没有条带，说明18株H7-HA单克隆抗体中既有线性表位又有构象表位。初步肽扫描结果显示，单抗2A2、2H6、3A8、3H3、7H7、9B6、11B8、12F11、13C10、14C2、15C5、16D2、17A2和21E2识别的抗原位点为GVTSACRRSGSSFYAEMK(142-159 aa)，单抗10A8识别的抗原位点为YKSTQSAIDQITGKLNRL(381-398 aa)，而另外3株单抗3E5、7A2和17A2不与多肽发生反应，识别的是构象表位。
以胶体金标记16株具有HI和中和活性的HA单抗，通过Dot-blot筛选配对单抗9B6和10A8。用30nm的胶体金颗粒标记单抗10A8制备金标抗体，分别以0.8mg/mL单抗9B6和1.3mg/mL兔抗鼠IgG在硝酸纤维素膜喷点检测线和质控线。通过系统优化试纸参数，研制H7亚型AIV胶体金检测试纸条，建立了H7亚型AIV试纸快速检测方法。对该胶体金检测试纸条的特性测定结果显示，试纸条对H7N9亚型AIV尿囊液的检测限为2.4log10EID50/0.1mL，与其他亚型AIV及常见禽源病毒无交叉反应，表明该试纸具有较好的特异性;该试纸可以检测到从2013-2017不同年份分离的H7N9亚型AIV，并且还可以检测到用于流感病毒三价灭活苗的H7-Re2抗原株，表明该试纸具有较好的广谱性;用该试纸检测H7N9亚型AIV尿囊液结果比血凝试验高2-8个血凝单位，表明该试纸具有较好的敏感性;保存期试验结果显示，保存6个月的试纸条对H7N9亚型AIV尿囊液的灵敏度未发生变化，表明该试纸具有较好的稳定性。本研究开发的H7亚型禽流感病胶体金检测试纸条方便、快速、可靠，为H7亚型禽流感病毒监测提供快速、简便的检测方法。
本研究以差速离心法纯化的H7N9亚型禽流感病毒A/Chicken/Huizhou/HZ-3/2017(HP)免疫BALB/c小鼠，通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和间接ELISA对杂交瘤细胞进行筛选，建立稳定分泌H7N9亚型AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞25株，其中18株靶向HA蛋白(2A2、2H6、3A8、3E5、3H3、7A2、7H7、9B6、10A8、11B8、12F11、13C10、14C2、15C5、16D2、16F2、17A2和21E2)，1株靶向NA蛋白(12F12)，6株靶向NP蛋白(7D11、8A6、11A8、13A6、15E11和18A2)。IPMA测定单抗腹水效价在1×10-4～1×10-6之间。亚型鉴定结果显示，大部分单抗重链亚型为IgG1(10A8为IgG2a，2A2为IgG2b)，轻链均为κ链。病毒反应谱测定结果显示，18株H7-HA单抗和1株H7-NA单抗与2013～2017年分离得到的H7N9亚型AIV反应，而不与其它亚型流感病毒反应;6株H7-NP单抗与部分其它亚型流感病毒发生反应。血凝抑制(HI)和病毒微量中和试验结果显示，16株H7-HA单抗的HI效价在4log2～13log2之间，病毒中和效价在1∶500～1∶16000之间，另外2株H7-HA单克隆抗体不具有HI和中和活性。Western-blot检测结果表明，18株H7-HA杂交瘤细胞培养上清中有15株均在63KDa附近出现一条特异性的蛋白质条带，而另外3株没有条带，说明18株H7-HA单克隆抗体中既有线性表位又有构象表位。初步肽扫描结果显示，单抗2A2、2H6、3A8、3H3、7H7、9B6、11B8、12F11、13C10、14C2、15C5、16D2、17A2和21E2识别的抗原位点为GVTSACRRSGSSFYAEMK(142-159 aa)，单抗10A8识别的抗原位点为YKSTQSAIDQITGKLNRL(381-398 aa)，而另外3株单抗3E5、7A2和17A2不与多肽发生反应，识别的是构象表位。
以胶体金标记16株具有HI和中和活性的HA单抗，通过Dot-blot筛选配对单抗9B6和10A8。用30nm的胶体金颗粒标记单抗10A8制备金标抗体，分别以0.8mg/mL单抗9B6和1.3mg/mL兔抗鼠IgG在硝酸纤维素膜喷点检测线和质控线。通过系统优化试纸参数，研制H7亚型AIV胶体金检测试纸条，建立了H7亚型AIV试纸快速检测方法。对该胶体金检测试纸条的特性测定结果显示，试纸条对H7N9亚型AIV尿囊液的检测限为2.4log10EID50/0.1mL，与其他亚型AIV及常见禽源病毒无交叉反应，表明该试纸具有较好的特异性;该试纸可以检测到从2013-2017不同年份分离的H7N9亚型AIV，并且还可以检测到用于流感病毒三价灭活苗的H7-Re2抗原株，表明该试纸具有较好的广谱性;用该试纸检测H7N9亚型AIV尿囊液结果比血凝试验高2-8个血凝单位，表明该试纸具有较好的敏感性;保存期试验结果显示，保存6个月的试纸条对H7N9亚型AIV尿囊液的灵敏度未发生变化，表明该试纸具有较好的稳定性。本研究开发的H7亚型禽流感病胶体金检测试纸条方便、快速、可靠，为H7亚型禽流感病毒监测提供快速、简便的检测方法。