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研究背景和目的非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)在全球的患病率约为25%,并且将继续上升[1,2]。NAFLD通常是一种复杂的进行性肝脏疾病,但症状并不局限于肝脏,其是代谢综合征的肝脏表现[3]。令人担忧的是,NAFLD可能与诸如肝硬化、肝细胞癌等重大并发症的死亡率增加相关[4]。由于其严重的并发症和合并症,NAFLD的医疗支出将会不断增加,对于患者个人和医疗保险系统都将会是沉重的负担[5]。NAFLD发病机制十分复杂,从最开始的“两次打击”假说发展到“多次打击”假说,其致病机理得到进一步的阐述[6,7],但仍未完全阐明。目前,临床中尚无有效且可长期口服治疗NAFLD的药物。因此积极探索新的治疗药物和途径具有重要的临床意义。近些年来,有关NAFLD和胆汁酸关系的研究越来越多,多项研究均表明胆汁酸的代谢紊乱促进了NAFLD的发生发展[8,9]。在NAFLD患者或NAFLD动物体内,发现血清胆汁酸含量增加,并且胆汁酸比例(初级胆汁酸和次级胆汁酸)发生了明显变化[10-12]。本课题组前期研究结果表明,降脂益生菌(鼠李糖乳杆菌GG和植物乳杆菌WCFS1)能够调控NAFLD大鼠胆汁酸生成限速酶胆固醇7α-羟化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1)的表达[13],但降脂益生菌对胆汁酸通路(FXR通路)及其代谢和转运机制的影响尚不明确。在本实验中,初步探讨了降脂益生菌对高脂饮食NAFLD小鼠FXR通路及胆汁酸代谢和转运的影响,进而为阐明降脂益生菌调控FXR通路改善小鼠NAFLD提供依据。1.FXR-/-小鼠繁殖和基因型鉴定实验方法FXR+/-雄鼠与FXR+/-雌鼠按1:1比例合笼繁殖。通过PCR扩增鼠尾DNA后琼脂糖凝胶电泳法鉴定小鼠基因型,Western Blot检测各基因型小鼠肝脏FXR蛋白表达情况。实验结果F1代小鼠共18只,其中FXR+/+小鼠6只(4雄2雌),FXR+/-小鼠9只(3雄6雌),FXR-/-小鼠3只(1雄2雌)。F2代FXR-/-小鼠8只(3雄5雌);Western Blot结果提示FXR-/-小鼠肝脏中FXR表达量极低,表明FXR基因敲除彻底。结论通过PCR扩增鼠尾DNA后琼脂糖凝胶电泳法可顺利、可靠的区分FXR+/+、FXR+/-和FXR-/-基因型小鼠。2.高脂饮食对FXR-/-小鼠糖脂代谢及肝脏脂肪变性的影响实验方法ND(WT)组和ND(FXR-/-)组小鼠(n=6)给予维持饲料喂养12周。HFD(WT)组和HFD(FXR-/-)组小鼠(n=6)给予高脂饲料喂养12周。处死小鼠后全自动生化分析仪检测血清脂质、总胆汁酸水平和肝功能指标;RT-PCR检测肝脏炎症因子和FXR下游基因在mRNA水平的相对表达量;HE染色观察肝脏脂肪变性情况。实验结果(1)HFD(WT)组和HFD(FXR-/-)组小鼠体重无差异,但HFD(FXR-/-)组小鼠表现出严重的糖耐量受损(P<0.01)、脂质代谢紊乱(P<0.01)、肝功能受损(P<0.01)和血清胆汁酸水平增加(P<0.01)。(2)和 HFD(WT)组相比,HFD(FXR-/-)组小鼠 TNF-α、TLR4 和 SR-B1在mRNA水平相对表达量明显增加(P<0.01)。(3)相比WT小鼠,ND(FXR-/-)组和HFD(FXR-/-)组小鼠肝脏SHP在mRNA水平相对表达量明显下降(P<0.01),而CYP7A1相对表达量明显增加(P<0.01)。(4)ND(WT)组和ND(FXR-/-)组小鼠肝脏结构大致正常;HFD(WT)组小鼠肝索结构排列紊乱,散在可见脂肪空泡分布,但未发现有炎细胞浸润;HFD(FXR-/-)组小鼠肝索结构排列紊乱,肝细胞混浊肿胀,弥漫出现大量脂肪空泡,偶可见炎细胞浸润。结论FXR的缺失引起小鼠糖脂代谢紊乱、胆汁酸代谢异常、肝脏炎症和肝脏大泡脂肪变性,但这种改变需要高脂饮食的诱导。相比C57BL/6小鼠,高脂饮食诱导FXR-/-小鼠建立的NAFLD动物模型优势明显,更能反映其疾病特征。3.降脂益生菌改善高脂饮食FXR-/-小鼠非酒精性脂肪性肝病实验方法FXR-/-小鼠随机分3组(n=6):ND组小鼠给予维持饲料+生理盐水灌胃,HFD组小鼠给予高脂饲料+生理盐水灌胃,H+P组小鼠给予高脂饲料+降脂益生菌灌胃。干预12周后处死小鼠,全自动生化分析仪检测血清脂质、总胆汁酸水平和肝功能指标;RT-PCR检测小鼠肝脏和肠道炎症因子相对表达水平;Western Blot检测肠道黏膜屏障蛋白、肝脏和肠道FXR通路及胆汁酸转运相关蛋白的表达水平;HE染色评估肝脏和肠道组织病理变化。实验结果(1)和ND组相比,HFD组小鼠表现出明显的体重增加(P<0.01)、胰岛素抵抗和糖耐量受损(P<0.01),而降脂益生菌的干预可以改善上述症状。(2)和 ND 组相比,HFD 组小鼠血清 TC、LDL-C、HDL-C、ALT、AST和胆汁酸含量显著增加(P<0.01)。降脂益生菌干预后,TC、TG、LDL-C、胆汁酸含量下降(P<0.05)。(3)和ND组相比,HFD组小鼠肝脏TLR4、IL-1和TNF-α在mRNA水平相对表达量增加(P<0.01),SR-B1相对表达量下降(P<0.01)。降脂益生菌干预后,TLR4、IL-1和TNF-α相对表达量下降(P<0.05),SR-B1相对表达量增加(P<0.01)。(4)ND组小鼠肝脏结构大致正常;HFD组小鼠肝索结构排列紊乱,肝细胞混浊肿胀,弥漫出现大量脂肪空泡;H+P组减轻了 HFD组小鼠肝脂肪变性程度。(5)和ND组相比,HFD组小鼠肝脏SHP、FGFR4和BSEP蛋白表达量下降(P<0.01),CYP7A1蛋白表达量增加(P<0.01)。降脂益生菌干预后,SHP表达量无变化,FGFR4和BSEP蛋白表达量增加(P<0.05),CYP7A1蛋白表达量下降(P<0.01)。(6)和ND组相比,HFD组小鼠回肠TLR4、IL-1、IL-6和TNF-α在mRNA水平相对表达量增加(P<0.01)。降脂益生菌干预后,TLR4、IL-1、IL-6和TNF-α相对表达量下降(P<0.01)。(7)ND组小鼠肠道结构大致正常;HFD组小鼠小肠绒毛破裂、缺失,间隙扩大,上皮细胞坏死和脱落;H+P组小鼠肠道结构紊乱有所改善。(8)和ND组相比,HFD组小鼠ZO-1、Claudin-1和Claudin-3蛋白表达量下降(P<0.01)。和 HFD 组相比,H+P 组小鼠 Claudin-1、Claudin-3 和 FGF15 蛋白表达量增加(P<0.05)。结论降脂益生菌具有类似选择性肠道FXR激动剂的作用,可能通过调控FXR-FGF15通路改善胆汁酸代谢和转运,进而缓解高脂饮食FXR-/-小鼠的NAFLD。