【摘 要】
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流感是重要的人畜共患传染病之一,流感病毒感染不仅给畜牧业生产造成了重大损失,而且对公共卫生、人类健康造成了巨大的威胁,其中高致病性甲型流感病毒危害性最大。甲型流感病毒的抗原漂移和抗原转换,更使得人们在预防和治疗流感措手不及。因此,寻找新的抗流感病毒策略迫在眉睫。本实验通过比对分析具有代表性的甲型流感病毒株的血凝素（Hemagglutinin,HA）核苷酸序列,设计两条针对HA保守区的shRNA序列
【基金项目】
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国家自然科学基金（U1305212,31402217）
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流感是重要的人畜共患传染病之一,流感病毒感染不仅给畜牧业生产造成了重大损失,而且对公共卫生、人类健康造成了巨大的威胁,其中高致病性甲型流感病毒危害性最大。甲型流感病毒的抗原漂移和抗原转换,更使得人们在预防和治疗流感措手不及。因此,寻找新的抗流感病毒策略迫在眉睫。本实验通过比对分析具有代表性的甲型流感病毒株的血凝素（Hemagglutinin,HA）核苷酸序列,设计两条针对HA保守区的shRNA序列,成功构建出针对HA的shRNA表达载体:sh-HA-1与sh-HA-2。分别建立稳定表达sh-HA-1,sh-HA-2的A549细胞系。利用Western Blotting技术检测它们对HA表达的干扰效果。选取干扰效果更显著的干扰序列,用于制备干扰HA的转基因小鼠模型。感染WSN或PR8流感病毒后,观察分析转基因小鼠的形态特征、体重变化、存活率以及器官病变;进一步利用Western Blotting技术检测干扰HA转基因小鼠肺脏中流感病毒蛋白HA和NP的表达情况;采用病毒空斑实验检测肺脏组织中的病毒滴度;检测外周血白细胞数量;最后通过同笼感染实验观察转基因小鼠是否能够抑制流感病毒的水平传播。研究结果如下所示:（1）WSN或PR8感染稳定表达sh-HA-1和sh-HA-2的A549细胞系8 h和16 h后,流感病毒HA和NP的蛋白表达量都比对照组明显降低,证明我们设计的这两条shRNA均能有效干扰病毒HA的表达,从而抑制流感病毒的复制,且sh-HA-1的抑制效果优于sh-HA-2。（2）以干扰效果更好的sh-HA-1干扰载体,构建干扰HA的转基因小鼠模型。通过Genotyping鉴定干扰HA转基因小鼠后代的阳性率,检测结果接近50%。（3）干扰HA转基因小鼠和野生型小鼠同时感染WSN或PR8后,转基因小鼠的抗病毒能力明显比野生型小鼠强,表现为精神萎靡程度低,体重下降幅度较小,存活时间较长,肺脏病毒滴度更低;转基因小鼠的肺脏病变程度和脾脏、胸腺萎缩程度也均明显轻于野生型小鼠,且外周血中白细胞的数量也比野生型小鼠更高,表明其免疫力更强。（4）同笼感染流感病毒实验表明,转基因小鼠能够有效抑制流感病毒的水平传播能力。以上研究结果表明,我们成功构建了能够有效抵抗流感病毒感染的转基因小鼠模型,这些结果将为其它抗病毒动物的制备提供理论参考和技术支撑。
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