长春花是近年来被研究的最为热门的植物之一,我国主要种植于西南、中南、华东等省区,具有极其丰富的药用价值。长春花的主要次级代谢产物成分为生物碱,目前研究人员从长春花中已分离出130余种生物碱,其中有6种具有抗肿瘤的作用。然而,在天然的长春花中,这些生物碱的含量极少,再加上受生长环境和植物本身生长周期的影响,从天然长春花中提取这些生物碱更为有限,市场上呈现供不应求的状况。而且,这些次生代谢产物的合成途径极为复杂,化学合成过程复杂而且成本过高。近年来,研究人员通过解析长春花次级代谢途径中的关键酶及其作用机制,来探究如何利用基因工程的手段调控长春花生物碱的合成。研究表明,MicroRNA(简称miRNA)是很多植物中最重要的基因表达调控元件之一,它参与调控几乎所有的植物生理代谢过程,例如miR156,它的靶基因是被称作SPL(SQUAMOSA promoter binding protein-like)的家族。SPL蛋白质家族是植物特有的一大类转录因子家族,具有高度保守的DNA结合区域-SBP结构域,大部分含有miR156的识别位点。在拟南芥中,miR156通过负调控转录因子SPL9限制MYB-BHLH-WD40转录复合体的演变,进一步控制花青素合成基因DRF(dihydroflavonol refuctase)的表达,负调控花青素的合成。本文期望通过对长春花转录因子SPL9的基因进行克隆,预测并分析其氨基酸序列结构,探究在长春花中miR156与转录因子SPL9之间的作用机制,并进一步研究二者对长春花次级代谢途径中关键酶是否具有调控作用,最终为提升长春花次生代谢产物的积累量的研究提供思路和基础。本研究首先提取了长春花的总RNA,并反转录得到长春花cDNA,设计特异性引物,以cDNA为模板克隆出长春花SPL9基因,命名为CrSPL9。构建重组质粒pGMT-CrSPL9和pBI121GD-CrSPL9,并对CrSPL9基因序列进行同源序列比对以及氨基酸序列预测和分析。将质粒pBI121GD-CrSPL9以及来pCAMBIA2301-MIR156f通过农杆菌介导瞬时转化至长春花幼苗茎尖分生组织部位。利用qRT-PCR技术来分析miR156与转录因子SPL9的相互作用,并且根据基因表达的时空特异性,探究miR156及转录因子SPL9对长春花生物碱的环烯醚萜途径中的关键酶的调控作用。实验结果表明,我们从长春花叶片中成功克隆出1600bp左右的CrSPL9基因。将基因测序及同源序列比对后,从结果可以看出,长春花转录因子SPL9基因与榴莲(Durio zibethinus)转录因子SPL6基因的同源性最高,为81%;其次与油橄榄(Olea europaea var.)转录因子SPL6的基因相似度也颇高,为80%。对基因序列经过氨基酸序列预测后分析,我们发现CrSPL9具有高度保守的SBP结构域和一个高度保守的双向核定位信号KRXXXRRRK。CrSPL9基因序列包含miR156的识别位点,说明在长春花中CrSPL9也是miR156的靶基因。实时荧光定量PCR的结果表明,在野生型长春花的不同年龄叶片中,miR156和转录因子SPL9的表达具有时空特异性:miR156的表达量在新叶片中最高,随着叶片年龄的增长,其表达量也降低,而CrSPL9的表达量与miR156呈现相反的表达模式。瞬时转化pBI121GD-CrSPL9、pCAMBIA2301-MIR156f的长春花叶片中CrSPL9以及miR156的表达水平高于对照组。在过量表达CrSPL9以及miR156的植物中,环烯醚萜途径中的关键酶之一马钱子苷甲基转移酶基因(CrLAMT)受到相应的调控:在过量表达CrSPL9的长春花植株叶片中,CrLAMT的表达量受到抑制;在过量表达miR156的长春花植株叶片中,CrLAMT的表达量被明显上调。综上所述,本研究通过对长春花转录因子基因CrSPL9的克隆及分析,探究了转录因子的氨基酸结构,从分子水平印证了CrSPL9与miR156之间的关联。并且通过过量表达CrSPL9与miR156的方法,发现了它们对长春花次级代谢途径中关键酶——马钱子苷酸甲基转移酶(LAMT)具有调控作用。本研究将为miRNA及转录因子在长春花等药用植物次生代谢产物的调控研究奠定基础,并提供新的思路。