帕金森病(Parkinson Disease,PD)是世界第二大神经变性疾病。自从1963年Greer等证实了黑质中多巴胺神经元变性缺失是PD的主要病理特征以来,科学家一直在探讨引起黑质多巴胺能神经元缺失的因为。研究多巴胺能神经元死亡的分子信号转导机制,对揭示PD发生、发展的本质,寻找其药物治疗靶点,具有重要的研究意义。　　 6-羟基多巴(6-hydroxydopamine,6-OHDA)是一种常用于建立PD离体与在体模型的神经毒物。有报道,在生理状态下,人体中枢神经系统的多巴胺在代谢过程中也会产生中间产物6-OHDA。研究发现,在PD患者中脑黑质内,6-OHDA水平偏高,可损伤中脑黑质致密部的多巴胺能神经元,引起神经元内多巴胺代谢的异常,多巴胺能神经元特征性指标酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)表达的下降,最终导致多巴胺能神经元的死亡。因此,应用6-OHDA建立模型可很好地研究多巴胺能神经元损伤的分子信号转导机制,了解PD发病的过程。　　 凋亡是细胞死亡的一种重要形式,大量离体、在体研究表明,凋亡是一种与PD密切相关的重要分子机制。有研究小组报道,在PD患者黑质致密部中可观察到原位DNA碎片的出现；也有学者发现,在黑质致密部的多巴胺神经元中观察到核固缩、凋亡小体的出现。这些均提示,黑质致密部的多巴胺神经元很有可能发生了凋亡。众多应用6-OHDA研究PD的实验表明,6-OHDA可引起多巴胺能神经元的凋亡。研究发现,向大鼠单侧黑质注射6-OHDA后,可在黑质区域观察到DNA断裂、细胞固缩等凋亡特异性的形态学改变；在离体实验中,6-OFIDA能激活大鼠中脑原代多巴胺神经元的caspase-3、PARP(poly ADP-ribose polymerase),引起细胞凋亡。然而,6-OHDA引起多巴胺能神经元凋亡的机制并未完全清楚。有证据显示,6-OHDA是通过激活MN9D多巴胺能神经元中的caspase-9,进而启动内源性细胞凋亡信号通路,最终引起凋亡；但另一个研究小组则发现,6-OHDA可激活MN9D细胞中caspase-9和caspase-8,同时启动内源性细胞凋亡信号通路和外源性细胞凋亡信号通路；但是,有研究小组向大鼠单侧纹状体立体定位注射6-OHDA建立PD动物模型,并探讨多巴胺能神经元受损的机制,他们并未发现6-OHDA可激活caspase-9和caspase-3。因此,6-OHDA诱导细胞凋亡其中的信号转导通路仍有待研究明确。　　 近年,有不少学者发现GSK3β在细胞凋亡中发挥了重要的作用。在PI3K/AKT/GSK3β信号通路当中,PI3K(磷脂酰肌醇-3-激酶,phosphatidylinositol-3-kinase)磷酸化AKT(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)上Ser473位点,激活了AKT,后者磷酸化GSK3β,调节其活性,从而实现对其下游底物的调控。常见的GSK3β磷酸化位点主要有两个:一个是Ser9位点,另一个是Thr216位点。Ser9位点被磷酸化后可降低GSK3β的活性,而激活域中的Tyr216位点被磷酸化后则可提高GSK3β的活性,凋亡前信号主要是通过这两种方式调节GSK3β的活性,最终控制细胞凋亡的。一项关于放射损伤的研究发现,通过下调caspase-3等凋亡蛋白的表达,GSK3β的抑制剂可缓解C57BL/6J小鼠小肠受到的放射性损伤；有报道,组成性激活的GSK3β突变体可激活Bax,加剧代谢应激对肾上皮细胞的损伤。众多数据显示,GSK3β参与了多种组织的细胞凋亡过程。然而,在中枢神经系统中,有关GSK3β在多巴胺能神经元凋亡过程中所起作用方面的研究仍处于初级阶段。　　 有研究小组观察了PD患者脑组织切片,发现黑质中路易小体中除了表达α-共核蛋白外,还表达GSK3β及其磷酸化蛋白p-GSK3β(Ser9)；PD患者存在GSK3β的单核苷酸多态性；Chen等发现,GSK3β的抑制剂可缓解SH-SY5Y细胞中由内质网应激介导的细胞凋亡。然而,我们不能否认,作为外源性蛋白的抑制剂是有一定局限性的。因此,本课题的研究目的在于以下几点:　　 1.初步探讨6-OHDA是通过内源性凋亡通路还是外源性凋亡通路启动SH-SY5Y的凋亡:　　 2.明确6-OHDA是否通过激活GSK3β,最终启动SH-SY5Y多巴胺能神经元的凋亡;　　 3.通过shRNA干扰,沉默内源性GSK3β的表达,观察其对SH—SY5Y凋亡的影响,进一步阐明GSK3β在6-OHDA诱导SH—SY5Y凋亡中的作用。　　 结果：　　 1.6-OHDA损伤的SH-SY5Y帕金森病离体细胞模型中凋亡相关蛋白表达水平升高　　 用6-OHDA(100uM)培养基处理SH-SY5Y细胞0、2、4、6、8、12、24小时,收集蛋白后用PARP和caspase-3的特异抗体检测这两种凋亡相关蛋白活化状态的表达水平。结果显示,6-OHDA(100uM)处理SH—SY5Y细胞6小时后,活化的PARP与活化的caspase-3蛋白水平均明显升高,随着时间的延长表达水平持续升高,说明6-OHDA激活了SH-SY5Y细胞内的凋亡过程。为了进一步了解6-OHDA激活SH—SY5Y细胞凋亡的信号转导通路,我们用caspase-8和caspase-9的特异抗体检测这两种凋亡相关蛋白活化状态的表达水平。发现6-OHDA(100uM)处理SH-SY5Y细胞6小时后,活化的caspase-9蛋白的表达水平显著升高,且随着时间的延长表达水平持续升高,而活化的caspase-8蛋白表达水平未见明显变化。说明在SH—SY5Y细胞中,6-OHDA是通过激活内源性细胞凋亡信号通路,而不是通过激活外源性细胞凋亡信号通路引起细胞损伤的。　　 2.6-OHDA激活了SH-SYSY细胞中的GSK3β　　 用6—OHDA(100uM)培养基处理SH—SY5Y细胞0、2、4、6、8、12、24小时,收集蛋白后用PI3K和AKT的特异性抗体检测PI3K/AKT/GSK3β通路中这两个上游激酶的表达水平。结果发现,6—OHDA(100uM)处理SH—SYSY细胞6小时后,PI3K和AKT的蛋白表达水平均明显下降,并且随着时间的延长,这两种蛋白的表达水平进一步下降。这说明了6—OHDA可下调PI3K和AKT的表达,从而使AKT的激酶活性明显下降。在此基础之上,我们分别用GSK3β和两个磷酸化特异的GSK3β抗体,p—GSK3β(Ser9)和p-GSK3β(Tyr216),检测GSK3β是否被激活了。结果发现,6-OHDM100uM)处理SH-SY5Y细胞后,GSK3β的蛋白表达水平稍有下降；同时,6-OHDA(100uM)的处理下调了p—GSK3β(Ser9)的表达水平,并且上调了p-GSK3β(Tyr216)的表达水平,随着时间的延长,这两个磷酸化蛋白表达水平变化更明显了。这说明,6-OHDA激活了GKS3β。　　 3.小分子RNA干扰GSK3β可缓解SH-SY5Y中由6-OHDA引起的细胞凋亡　　 我们已经证明了6-OHDA可启动SH-SY5Y细胞的内源性细胞凋亡信号转导通路,引起细胞凋亡,我们也证明了6-OHDA可激活GKS3β,那么此二者是伴随关系还是先后关系呢?虽然Chen等的研究发现GSK3β的特异性抑制剂可缓解6-OHDA在SH-SY5Y中诱导的细胞凋亡,但内源性GSK3β在其中的作用仍未清楚。为了探求此点,我们使用小分子RNA干扰的技术特异性地沉默了SH—SY5Y细胞中GSK3β的表达,以了解内源性GSK3β对6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响。我们购买四个商品化的候选小分子RNA干扰表达质粒psiU6-shRNA-GSK3β-1、psiU6-shRNA—GSK3β-2、psiU6-shRNA-GSK3β—3、psiU6-shRNA-GSK3β-4,通过挑取单克隆细胞,并进行针对GSK3β的real-timePCR和Western Blotting,从RNA水平和蛋白质水平进行检测,我们成功筛选出对GSK3β干扰效率达70％以上的单克隆细胞psiU6-shRNA-GSK3β-SH-SY5Y。　　 然后,我们以6-OHDA(100uM)培养基分别处理SH-SY5Y细胞、含有空载体psiU6的psiU6-shRNA-control—SH-SY5Y单克隆细胞和psiU6-shRNA-GSK3β-SH—SY5Y单克隆细胞0、2、4、6、8、12、24小时后,检测细胞活力的变化。我们发现,6-OHDA(100uM)处理6小时后,均可引起三种单克隆细胞的细胞活力下降,但在psiU6-shRNA-GSK3β-SH-SY5Y单克隆细胞中细胞活力下降程度明显少于SH—SY5Y细胞和psiU6-shRNA-control-SH—SY5Y单克隆细胞的下降程度,并且这种差别随着6-OHDA处理时间的延长持续存在。这说明了,GSK3β的小RNA干扰可缓解6-OHDA对SH—SY5Y的损伤。　　 既然沉默内源性GSK3β表达可缓解6-OHDA对SH-SY5Y的损伤,那么这种损伤的缓解是否是由于下调了细胞内的凋亡而实现的呢?为此,我们以6-OHDA(100uM)培养基分别处理psiU6-shRNA-control-SH—SY5Y单克隆细胞和psiU6-shRNA-GSK3β-SH—SY5Y单克隆细胞0、4、8、24小时后,检测这两种单克隆细胞caspase-3、caspase-8和caspase-9活化状态蛋白的表达水平。结果显示,6-OHDA(100uM)处理4小时后,psiU6-shRNA-control—SH-SY5Y单克隆细胞和psiU6-shRNA-GSK3β-SH-SY5Y单克隆细胞中活化caspase-3和活化caspase-9的表达水平均明显升高,但psiU6-shRNA-GSK3β-SH—SY5Y单克隆细胞中此两种蛋白表达水平升高程度则明显小于前者,随着6-OHDA处理时间的延长,这种差别持续存在。这说明了,小分子RNA干扰GSK3β可缓解SH—SY5Y中由6-OHDA引起的细胞凋亡。　　 到目前为止,有关GSK3β在PD多巴胺能神经元死亡作用的研究多采用GSK3β的特异抑制剂开展,本课题首次采用特异靶向GSK3β的shRNA干扰技术,研究GSK3β在6-OHDA诱导多巴胺能神经元凋亡过程中的作用。此外,本课题也证明了,在PD离体细胞模型SH-SYSY中,6-OHDA是通过内源性凋亡通路来激活凋亡的。但由于时间有限,我们未应用GSK3β的组成性激活突变体(constitutivelyactive mutant)和显性负性突变体(dominant negative mutant)来展开进一步的研究。　　 结论：　　 1.6-OHDA通过启动SH-SY5Y细胞中内源性细胞凋亡而引起细胞损伤；　　 2.沉默内源性GSK3β可部分缓解6-OHDA对SH-SY5Y细胞的损伤；　　 3.GSK3β介导了6-OHDA在SH-SY5Y中诱导的内源性细胞凋亡。