论文部分内容阅读
青枯病是番茄（Solanum lycopersicum）生产中最严重的细菌病害之一,但目前抗性种质、尤其是广谱抗病基因的挖掘还非常有限。为进一步挖掘番茄青枯病抗性基因,对抗、感青枯病番茄自交系接种青枯菌（Ralstonia solanacearum）前后主要防御酶活性进行测定和转录组测序。同时,为深入研究NBS-LRR和Mlo两类关键抗病基因的遗传特征,加快番茄青枯病遗传改良应用,利用生物信息学、比较基因组学和分子生物学方法对其进行了系统鉴定和分析。主要研究结果如下:1、青枯菌侵染后,不同番茄材料POD和PPO活性整体下降,但抗病材料比感病材料下降缓慢。抗病材料PAL活性整体上升,而感病材料下降。抗病材料GST活性整体低于感病材料。抗病材料β-1,3-GA和几丁质酶活性整体上升;感病材料β-1,3-GA前期变化不明显,后期上升,而几丁质酶活性下降。2、鉴定出1312个（含32个新基因）差异表达基因（DEGs）,上调和下调基因数目分别为693和621。其中,材料特异DEG有836个（含18个新基因和Sl NLR5）。结合共表达分析,确定27个关键DEGs。1290个DEGs被注释到八大数据库,包括9个NBS-LRR基因、11个植病互作基因、16个植物激素信号转导基因、37个防御反应基因、70个蛋白激酶和95个转录因子（TFs）等重要功能基因。Sl NLR5、Sl Mlo1和Sl Mlo6是基因集富集分析（GSEA）中的核心防御基因。选取62个代表DEGs进行RT-q PCR验证,发现Solyc01g080220.3、Solyc02g086980.3、Solyc04g011670.3、Solyc04g058170.1、Solyc08g068480.1和Solyc10g006710.4可能参与抗病反应,Solyc01g073985.1、Solyc03g093560.1、Solyc07g040960.1、Solyc08g079430.3、Solyc09g092580.4、Solyc09g098100.4和Solyc10g081300.1可能参与感病反应。3、检测到336个miRNA,包括193个新miRNA。其中,31个差异表达miRNA（DE miRNA）靶向调节575个基因的表达,含31个DEGs,组成17对材料特异miRNA-Targets。556个靶基因被注释,包括39个NBS-LRR基因、4个植病互作基因、5个植物激素信号转导基因、42个防御反应基因、35个蛋白激酶、73个TFs和诸多其他重要功能基因。DE miRNA靶TF下游调控基因启动子除典型的转录起始TATA-box和CAAT-box,及与生物胁迫相关的W box和TC-rich repeats,还存在激素、光、非生物胁迫等响应元件。RT-q PCR验证发现6对miRNA-Targets具有正-负、负-正和负-负三种番茄青枯病应答模式。4、结合转录组测序结果,选取两类重要基因进一步进行全基因组鉴定。在栽培番茄、野生潘那丽番茄（S.pennellii）和醋栗番茄（S.pimpinellifolium）中分别发现238、202和217个NBS-LRR基因,其中TNL、CNL和RNL型基因分别为58、87和13个。番茄NBS-LRR抗病基因主要定位于细胞核、细胞质和叶绿体。不均衡地散布于染色体两端,形成多个基因簇和串联重复,尤其是4和6号染色体。超过50%的NBS-LRR以同源基因形式存在,包括115对直系同源基因和8对旁系同源基因,绝大多数Ka/Ks均小于1,说明进化中主要受到纯化选择。基于EST和RNA-seq数据表明,番茄NBS-LRR基因主要在根和叶中表达,多数基因能够响应不同生物胁迫。RT-q RCR发现Solyc01g008800.2可能参与青枯病抗病反应,而其他基因可能参与感病反应。调控靶基因的TF和互作蛋白分别以Dof、NAC和MYB家族类和激酶类为主。5、197个Mlo基因被鉴定,部分Mlo含信号肽和钙调素结合区,绝大多数Mlo定位于细胞膜,含5-7个跨膜螺旋结构。143个Mlo基因CDS序列共检测到359个多态位点,生成142个单倍型,表现出丰富的遗传多态性。174个Mlo不均衡地散布于不同染色体或Scaffold上,且主要位于两端,形成19个（24%）基因簇、5对（6%）串联重复和61对（36%）片段重复。25对直系同源基因和28对旁系同源基因Ka/Ks值为0.01-0.78,说明进化中主要受到纯化选择。启动子分析发现番茄Mlo包含多个生物和非生物胁迫响应元件,尤其是Sl Mlo1、Sl Mlo4、Sl Mlo5和Sl Mlo12。RT-q RCR发现Sl Mlo1、Sl Mlo2、Sl Mlo4和Sl Mlo6可能参与青枯病感病反应,Sl Mlo14和Sl Mlo16可能参与抗病反应。同时,鉴定出靶向12个Sl Mlo的26个miRNA。6、基于差异表达基因的组学特征,进一步进行功能研究。将目的基因Sl NLR5连入由35S启动子驱动的植物表达载体p BGV008、将Sl Mlo1/6干扰片段连入VIGS载体p TRV2、将含高效靶点的DNA片段连入CRISPR载体p BGK01,构建形成三种载体,进一步转化获得T0代番茄苗。13株（68%）过表达转化株经PCR扩增出现284bp特异条带。9个编辑单株靶点测序发现,M1为Sl Mlo6杂合突变体;M2和M8基因Sl Mlo1分别缺失177bp和7bp长的序列片段,而Sl Mlo6为杂合型突变;M3和M10为Sl Mlo1杂合突变体;M4和M6均为双基因杂合突变体;M7基因Sl Mlo6缺失12bp长的序列片段,而Sl Mlo1为杂合型突变;M9发生Sl Mlo6单碱基T插入,而Sl Mlo1为杂合型突变。RT-q PCR表明,与野生型相比,转化株Sl NLR5表达水平显著上升（P＜0.01）,Sl Mlo1和Sl Mlo6表达水平均显著下降（P＜0.01）,OE4和OE5、M2、M4和M8效果最明显。对沉默株抗青枯病表型进行初步鉴定,表明Sl Mlo1/6可能负调控番茄青枯病抗性。综上,PAL、β-1,3-GA和几丁质酶可作为番茄青枯病抗性早期鉴定的参考指标。同时,多个抗性基因（负调控）及其调控miRNA在番茄响应青枯病方面发挥了重要作用。新基因对抗病系细胞壁的特异调控及部分DEG在感病系中的上调表达可能是不同抗性的主要来源,一些基因可能协同调控病害和干旱等不同胁迫。番茄NBS-LRR和Mlo基因具有丰富的遗传多样性和成簇存在的特点,在保守进化过程中经重复扩张和纯化选择,形成了大量同源基因。Sl NLR5和Sl Mlo1/6可能参与番茄青枯病抗性反应。功能基因受位点变异、可变剪接、非编码RNA、基因互作、表观修饰等多种因子调控。遗传转化分别获得13株番茄Sl NLR5过表达苗和9株Sl Mlo1/6编辑苗。表型鉴定表明Sl Mlo1/6可能负调控番茄青枯病抗性。基因功能转变主要是由于氨基酸丢失、翻译提前终止和移码突变。本研究对番茄的青枯病抗性基因进行了系统挖掘,首次分析了广谱抗性的可能应用,结果为相关分子调控机制研究、基因分离及抗病育种应用（尤其是S基因）提供了基础。