锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus,KHV）又称为鲤疱疹病毒3型（Cyprinid herpesvirus3,Cy HV-3）,该病毒引起的锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus disease,KHVD）可以感染鲤（Cyprinus carpio）、锦鲤（Cyprinus carpio haematopterus）并造成宿主80%以上的死亡率,严重威胁鲤、锦鲤养殖业的安全。目前,KHV研究中面临着敏感细胞系缺乏的现状,限制了其在KHV预防和治疗中的研究及应用;此外,KHV囊膜蛋白基因的DNA疫苗在KHV防治中表现出良好的应用前景,并且KHV可能存在多个DNA疫苗的靶分子。因此,本研究旨在建立一株KHV敏感的细胞系,为病毒诊断、疫苗生产等科学研究提供合适的体外模型;通过系统比较KHV囊膜蛋白的免疫保护效果,筛选理想的DNA疫苗候选分子,为建立多靶点基因的DNA疫苗提供依据。本文对建鲤脑组织中分离的原代细胞进行培养条件分析,发现CCB-J细胞可以在25℃含有20%胎牛血清的L-15培养基中生长良好,并且稳定传代超过60代;在第30代,核型分析显示CCB-J细胞染色体众数为100,这与其他鲤鱼品种相同;18S r DNA的测序结果证实CCB-J细胞起源于建鲤;采用lip3000的方法转染p EGFP-N1质粒后,在CCB-J细胞中观察到绿色荧光蛋白表达的绿色荧光;通过RT-PCR分析和透射电子显微镜观察证实了KHV可以在CCB-J细胞中完成复制;对感染KHV的CCB-J细胞和CCB细胞分别进行Taq Man-PCR分析,结果显示KHV在CCB-J细胞中的繁殖速度快于已广泛用于KHV研究的鲤鱼脑细胞（CCB）;同时在感染KHV的相同时间内,CCB-J细胞中观察到比CCB细胞明显的细胞病变效应（CPE）。在KHV保护性抗原初步筛选的前期研究中,将KHV的14个囊膜蛋白基因ORF25、ORF32、ORF59、ORF65、ORF81、ORF83、ORF99、ORF108、ORF115、ORF131、ORF132、ORF136、ORF148、ORF149分别插入p EGFP-N1载体,成功构建14个重组质粒。本文将重组质粒用作KHV DNA疫苗的候选分子,大量制备后与对照组PBS、p EGFP-N1分别进行建鲤的免疫;第3次免疫2周后,收集在CCB-J细胞中增殖的KHV病毒液并对免疫的建鲤进行滴鳃攻毒保护实验,统计建鲤的死亡情况,发现对照PBS组和p EGFP-N1组的建鲤存活率分别为25%、30%;ORF115、ORF132和ORF148的重组质粒免疫后,建鲤的存活率为65%;ORF99重组质粒免疫后的建鲤存活率为75%;ORF65、ORF83和ORF131重组质粒免疫后,建鲤存活率达到80%以上,其中p EGFP-ORF65组和p EGFP-ORF131组的建鲤存活率能够达到90%;采用PCR的方法,随机对死亡建鲤的脑组织进行KHV的检测,结果均为阳性。本文选择重组质粒p EGFP-ORF65继续进行研究,通过重组质粒转染进入CCB-J细胞实验、重组质粒和对照组的建鲤活体成像实验,证实了重组质粒p EGFP-ORF65的p ORF65-EGFP融合蛋白可以在建鲤的体外、体内表达;采用ELISA方法检测p EGFP-ORF65组与对照组PBS、p EGFP-N1的血清抗体水平,结果显示p EGFP-ORF65组的抗体水平与对照组的抗体水平有显著性差异（P<0.05）,表明p EGFP-ORF65可以诱导机体产生抗体,加强免疫可以显著提高血清特异性抗体水平。综上所述,本研究成功建立的建鲤脑细胞系即CCB-J细胞系,可以用作病毒发病机理和疫苗研究的有力工具。通过比较KHV中14个囊膜蛋白分子的免疫保护效果,初步筛选ORF65、ORF83和ORF131的重组质粒在免疫后可以显著降低建鲤的死亡率;选择保护效果较突出的KHV ORF65继续深入研究,为DNA疫苗靶基因应用于KHV的防控提供依据。