生物被膜是指细菌细胞聚集在一起形成的，由胞外基质(ECM)包围的复杂的多细胞聚合体。生物被膜的形成可以保护病原菌抵御抗生素的治疗，同时也是形成慢性感染的常见原因。所以了解细胞如何形成生物被膜的机制对于人类健康和现代医学的发展非常重要。近年来，由环二鸟苷酸(Bis-(3-5)-cyclic dimeric GMP，c-di-GMP)介导的生物膜形成的机制在铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌中得到了广泛的研究。　　c-di-GMP是细菌内广泛存在的第二信使，可以调控细菌的行为以适应外界多变的环境。细胞内c-di-GMP的浓度受二鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclases，DGCs)和磷酸二酯酶(phosphodiesterases，PDEs)的共同调控。DGCs催化两个GTP缩合为环状的c-di-GMP，而PDEs则可以将c-di-GMP水解为pGpG，最终分解为两分子的GMP。从结构上来说，DGCs一般含有GG[D/E]EF结构域，而PDEs则含有EAL或者HD-GYP结构域。高浓度的c-di-GMP促进生物膜的形成，而低浓度的c-di-GMP则会导致生物膜数量的下降。　　在铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌中，科研人员最近发现了一个由外向内进行信号传递的c-di-GMP信号调节通路。该通路由YfiB、YfiR以及YfiN三个蛋白构成，被称为YfiBNR系统。一般认为，当感受到某种外界压力后，细胞外膜上的YfiB蛋白会招募周质腔蛋白YfiR，从而激活YfiN蛋白的DGC酶功能，使得c-di-GMP浓度增高。近五年来，这个系统中YfiB蛋白的非跨膜区、YfiR蛋白（不包括信号肽）以及二者的复合物蛋白晶体结构被解析，使对这个系统有了更深层次的认识。但是很多细节的问题，包括外界因素例如环境中的一些小分子是如何影响YfiBNR系统还不得而知。在本研究中，通过分子置换法解析了YfiR蛋白分别结合小分子VB6、Trp、GMP的晶体结构以及结合GMP分子的YfiBL43P-YfiR蛋白晶体结构。　　YfiR-VB6/Trp的结构显示，VB6和Trp分子在相同的位置以疏水相互作用结合在YfiR蛋白单体的一侧。对比这一结构与YfiB-YfiR复合物结构可以发现，这两个分子的结合位点与YfiB蛋白的第57位苯丙氨酸在YfiR上的结合口袋重合，从而形成空间位阻，一定程度上阻碍YfiB-YfiR复合物的形成。生物膜定量分析实验也证实了这一猜测。在YfiR-GMP的结构中，GMP分子以氢键相互作用结合在YfiR蛋白上，结合口袋的氨基酸侧链也发生了一定程度的位移来容纳GMP分子。在YfiBL43P-YfiR-GMP的结构中，GMP分子分别与YfiB蛋白和YfiR蛋白形成氢键，暗示其能够促进二者的结合，这一推论由生物膜定量分析和亲和力试验所证实。对比VB6/Trp和GMP两类分别调控生物膜“关”和“开”的小分子，其结合口袋的位置和结合方式都有明显的不同。这些结果不仅丰富了对于YfiBNR系统的认识，也为抑制由铜绿假单胞菌生物膜引起的抗生素耐药性和持续性感染提供了新的药物靶点。　　除此之外，还对YfiB蛋白全长、YfiN蛋白全长以及YfiR-YfiN复合物蛋白进行了构建、表达和纯化。目前的进展包括成功表达了全长YfiB、全长及N端截短体YfiN以及全长YfiR-YfiN复合物蛋白，并成功拿到了少量YfiR-YfiN复合物的蛋白。考虑到复合物分子量大小，下一步计划使用冷冻电镜进行结构学研究。电镜制样条件的摸索正在进行中。后续的结构学研究会进一步完善对于YfiBNR系统的认识。