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本研究以牦牛胃溶菌酶（Lysozyme,LYZ）基因为研究对象,利用PichiaPink?表达系统对牦牛胃溶菌酶进行异源表达,探索提高牦牛胃溶菌酶的真核表达量的方法,为后续建立重组牦牛胃溶菌酶的生产工艺和规模化生产奠定基础。研究结果如下所示:1.通过PichiaPink?表达系统构建了真核表达载体pPinkα-HC-LYZ-Y-1a,并转化至宿主Pichia Pink?菌株2,得到了酵母菌株,此菌
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本研究以牦牛胃溶菌酶（Lysozyme,LYZ）基因为研究对象,利用PichiaPink?表达系统对牦牛胃溶菌酶进行异源表达,探索提高牦牛胃溶菌酶的真核表达量的方法,为后续建立重组牦牛胃溶菌酶的生产工艺和规模化生产奠定基础。研究结果如下所示:1.通过PichiaPink?表达系统构建了真核表达载体pPinkα-HC-LYZ-Y-1a,并转化至宿主Pichia Pink?菌株2,得到了酵母菌株,此菌株可以分泌表达重组牦牛胃溶菌酶,当重组的菌株通过甲醇诱导之后,在培养基中培养96 h时表达量最高。SDS-PAGE显示重组牦牛胃溶菌酶的分子量约为15.6KDa,发酵上清中重组牦牛胃溶菌酶比活性为1428.58U/mg。2.探讨重组牦牛胃溶菌酶对大肠杆菌O111所致小鼠腹泻的治疗作用。用大肠杆菌O111建立小鼠腹泻模型,增加抗生素治疗组、鸡蛋清溶菌酶治疗组、某公司溶菌酶产品治疗组对照组,通过观察小鼠精神变化、体重变化、采食量变化、血常规、小肠病理切片以及肠道菌群变化的情况,评价重组牦牛胃溶菌酶对小鼠的抗腹泻作用。通过血常规分析,抗生素治疗组、鸡蛋清溶菌酶治疗组与空白组相比差异不显著（P＞0.05）,治疗效果显著;而重组牦牛胃溶菌酶与空白组相比差异较显著（P＜0.05）,有一定治疗效果;某公司溶菌酶产品治疗组与空白组相比差异显著（P＜0.05）,治疗效果不显著。3.病理组织学观察,空白组的小鼠,小肠的绒毛健康,层次清晰,排列整齐,其高度及肠壁厚度趋于正常;模型组小鼠小肠绒毛排列紊乱,肠壁明显变薄,小肠绒毛变短并且出现断裂的现象,上皮细胞肿胀,大部分脱落;抗生素治疗组、鸡蛋清溶菌酶治疗组的治疗效果与正常组相似,治疗效果明显。重组牦牛胃溶菌酶治疗组小肠绒毛有所恢复,治疗效果较明显。某公司溶菌酶产品治疗组的小肠绒毛仍有大部分断裂,治疗效果不明显。4.肠道菌群分析,治疗组的肠道菌群的有害菌比例降低,与正常组的组间距最小,治疗腹泻效果明显。某公司溶菌酶产品治疗组的肠道菌群存有小部分的有害菌,治疗效果不明显。综上,重组牦牛胃溶菌酶对小鼠腹泻治疗效果显著,对小鼠肠道菌群有所改善,为日后治疗细菌性腹泻的疾病提供理论依据。
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