【摘 要】
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目的:慢性心力衰竭（Chronic Heart Failure,CHF）的发病率及死亡率高居不下,而心肌纤维化（myocardial fibrosis,MF）是影响CHF的重要因素,同时也是冠心病,高血压性心脏病,扩张型心肌病等多种心血管疾病共同的病理基础,因此,有效调控或预防MF已成为CHF防治的新靶标。微小RNA（MicroRNA,miRNA）及外泌体目前已被报道参与包括心血管系统疾病在内的多
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目的:慢性心力衰竭（Chronic Heart Failure,CHF）的发病率及死亡率高居不下,而心肌纤维化（myocardial fibrosis,MF）是影响CHF的重要因素,同时也是冠心病,高血压性心脏病,扩张型心肌病等多种心血管疾病共同的病理基础,因此,有效调控或预防MF已成为CHF防治的新靶标。微小RNA（MicroRNA,miRNA）及外泌体目前已被报道参与包括心血管系统疾病在内的多种疾病,其对心肌纤维化也有着重要的调控作用。在祖国医学中,CHF可归属于“心悸”、“水肿”或是“喘证”范畴,温中益气方在传统温阳、行气、利水的治疗基础上兼顾了脾胃的调补,可有效治疗CHF。本研究拟挖掘并验证在CHF中出现差异表达的miRNA,明确miRNA和外泌体之间的关系,最后探讨miRNA对心肌纤维化的影响及温中益气方治疗作用的潜在机制,以期探索出一条防治CHF的新思路。方法:第一部分:通过基因数据库寻找在慢性心力衰竭中差异表达的miRNA并明确其靶基因。第二部分:RT-PCR验证基因芯片数据,检测血清ST2表达量。探讨miRNA、ST2与NT-pro BNP、LEVF、NYHA分级间的关联性。第三部分:试剂盒提取外泌体,Wesont blot、NTA、透射电镜鉴定外泌体。PCR检测各组外泌体、提取外泌体后剩余部分中miR-320a水平。将外泌体与心肌成纤维细胞共养,观察细胞摄取情况,评估外泌体对细胞的影响。第四部分:miR-320a模拟物、抑制物转染细胞,制备含药血清,MTT、流式细胞仪检测细胞活力及凋亡情况,ELISA检测ST2,PCR检测PIK3CA转录水平,Weston blot法检测α-SMA、Ⅰ型、Ⅲ胶原及PIK3CA的表达。评估含药血清干预下对PIK3CA,α-SMA、Ⅰ型、Ⅲ胶原、ST2水平的影响。结果:第一部分:生物信息学分析结果示miR-320a在慢性心力衰竭患者中呈差异性上调,PIK3CA或为其潜在靶基因。第二部分:miR-320a、ST2在慢性心力衰竭患者血清中显著上调（p<0.05）、（p<0.01）;慢性心力衰竭患者中miR-320a与s ST2、NT-pro BNP以及NYHA心功能分级之间呈正相关性,与LEVF呈明显负相关。第三部分:外泌体表面标志物CD63/CD9/TSG101呈阳性表达,NTA径粒分析示外泌体颗粒大小正常,电镜下捕捉到外泌体结构。外泌体中miR-320a水平HF组>NOR组,miR-320a主要来源于外泌体中（p<0.05）,外泌体可被心肌成纤维细胞摄取,并通过外泌体转运miR-320a促使细胞miR-320a上调。第四部分:miR-320a可通过其靶基因PIK3CA刺激心肌成纤维细胞增殖,并使α-SMA、Ⅰ型、Ⅲ胶原、ST2水平上升（p<0.01）。温中益气方可下调心肌成纤维细胞中miR-320a及PIK3CA的表达（p<0.05）,抑制心肌成纤维细胞增殖,促进细胞早期凋亡,减少α-SMA、Ⅰ型、Ⅲ胶原的产生,并下调ST2、表达水平对抗心肌纤维化。结论:1、miR-320a在慢性心力衰竭患者的血清及外泌体中高表达,血清中的miR-320a主要来源为外泌体。2、miR-320a在慢性心力衰竭患者中与ST2、NT-pro BNP以及NYHA心功能分级之间呈正相关性,与LEVF呈明显负相关。3、心肌成纤维细胞可摄取外泌体,miR-320a可通过外泌体进行转运并使细胞内miR-320a水平上调。4、miR-320a通过其靶基因PIK3CA促进心肌纤维化。5、温中益气方可以抑制心肌成纤维细胞的增殖促使细胞早期凋亡,下调miR-320a、ST2、PIK3CA表达,减少ECM的产生,起到改善心肌纤维化的作用。
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